TY  - JOUR
A1  - Ribitsch, D.
A1  - Karl, W.
A1  - Birner-Gruenberger, R.
A1  - Gruber, K.
A1  - Eiteljoerg, I.
A1  - Remler, P.
A1  - Wieland, S.
A1  - Siegert, Petra
A1  - Maurer, Karl-Heinz
A1  - Schwab, H.
T1  - C-terminal truncation of a metagenome-derived detergent protease for effective expression in E. coli
JF  - Journal of biotechnology
N2  - Recently, a new alkaline protease named HP70 showing highest homology to extracellular serine proteases of Stenotrophomonas maltophilia and Xanthomonas campestris was found in the course of a metagenome screening for detergent proteases (Niehaus et al., submitted for publication). Attempts to efficiently express the enzyme in common expression hosts had failed. This study reports on the realization of overexpression in Escherichia coli after structural modification of HP70. Modelling of HP70 resulted in a two-domain structure, comprising the catalytic domain and a C-terminal domain which includes about 100 amino acids. On the basis of the modelled structure the enzyme was truncated by deletion of most of the C-terminal domain yielding HP70-C477.

This structural modification allowed effective expression of active enzyme using E. coli BL21-Gold as the host. Specific activity of HP70-C477 determined with suc-l-Ala-l-Ala-l-Pro-l-Phe-p-nitroanilide as the substrate was 30 ± 5 U/mg compared to 8 ± 1 U/mg of the native enzyme. HP70-C477 was most active at 40 °C and pH 7–11; these conditions are prerequisite for a potential application as detergent enzyme. Determination of kinetic parameters at 40 °C and pH = 9.5 resulted in KM = 0.23 ± 0.01 mM and kcat = 167.5 ± 3.6 s⁻¹. MS-analysis of peptide fragments obtained from incubation of HP70 and HP70-C477 with insulin B indicated that the C-terminal domain influences the cleavage preferences of the enzyme. Washing experiments confirmed the high potential of HP70-C477 as detergent protease.
Y1  - 2010
U6  - https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2010.09.947
SN  - 1873-4863 (E-Journal); 0168-1656 (Print)
VL  - 150
IS  - 3
SP  - 408
EP  - 416
PB  - Elsevier
CY  - Amsterdam
ER  - 
TY  - GEN
A1  - Pasteur, A.
A1  - Ludwig, B.
A1  - Tippkötter, Nils
A1  - Diller, R.
A1  - Kampeis, P.
A1  - Ulber, Roland
T1  - Aufarbeitung von β-Lactamantibiotika mittels selektiver, magnetischer Adsorbermaterialien
T2  - Chemie Ingenieur Technik
N2  - b-Lactame gehören zu den wirkungsvollsten Antibiotika, jedoch lassen sich viele nur schwierig fermentativ erzeugen. Ein Problem bei der fermentativen Produktion ist die Hydrolyse des Lactamrings im wässrigen Milieu. Das Ziel des von der DBU geförderten Projekts ist die selektive In-situ-Adsorption der b-Lactamantibiotika unter anschließender magnetischer Separation. Durch die Isolation im Hochgradientenmagnetseparator (HGMS) ist eine Fest-fest-flüssig-Trennung und somit ein erheblicher Zeitgewinn im Downstreamprozess möglich. Zusätzlich kommt es zur Einsparung an Lösungsmittel und Energie, was neben Reduzierung der Antibiotikahydrolyse auch in ökologischer Hinsicht einen interessanten Aspekt darstellt. Als Trägermaterial für die Adsorbermatrix werden magnetisierbare Eisenoxidpartikel eingesetzt, die in einer Silikamatrix eingebettet sind. Diese Adsorber sollen auf Selektivität in Wasser und verschiedenen Medien getestet werden. Zusätzlich werden die Abbauprodukte des b-Lactams analysiert, um eine Aussage über die Stabilisierung des Antibiotikums durch die selektiven Adsorber treffen zu können. Diese Ergebnisse werden mit kommerziell erhältlichen Adsorbern verglichen. Die Aufreinigung der Antibiotika soll direkt aus der Fermentationsbrühe erfolgen. Um die Trennung der magnetischen, selektiven Adsorber von der Biomasse zu gewährleisten, soll der HGMS in die Fermentation integriert werden. Das filamentöse Wachstum des Mikroorganismus erfordert eine Neuauslegung der Filtermatrix.
KW  - β-Lactame
KW  - Magnetische Adsorbermaterialien
Y1  - 2010
U6  - https://doi.org/10.1002/cite.201050270
N1  - ProcessNet-Jahrestagung 2010 und 28. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, 21. - 23. September 2010, Eurogress Aachen
VL  - 82
IS  - 9
SP  - 1587
PB  - Wiley-VCH
CY  - Weinheim
ER  -