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C-terminal truncation of a metagenome-derived detergent protease for effective expression in E. coli
(2010)
Recently, a new alkaline protease named HP70 showing highest homology to extracellular serine proteases of Stenotrophomonas maltophilia and Xanthomonas campestris was found in the course of a metagenome screening for detergent proteases (Niehaus et al., submitted for publication). Attempts to efficiently express the enzyme in common expression hosts had failed. This study reports on the realization of overexpression in Escherichia coli after structural modification of HP70. Modelling of HP70 resulted in a two-domain structure, comprising the catalytic domain and a C-terminal domain which includes about 100 amino acids. On the basis of the modelled structure the enzyme was truncated by deletion of most of the C-terminal domain yielding HP70-C477.
This structural modification allowed effective expression of active enzyme using E. coli BL21-Gold as the host. Specific activity of HP70-C477 determined with suc-l-Ala-l-Ala-l-Pro-l-Phe-p-nitroanilide as the substrate was 30 ± 5 U/mg compared to 8 ± 1 U/mg of the native enzyme. HP70-C477 was most active at 40 °C and pH 7–11; these conditions are prerequisite for a potential application as detergent enzyme. Determination of kinetic parameters at 40 °C and pH = 9.5 resulted in KM = 0.23 ± 0.01 mM and kcat = 167.5 ± 3.6 s⁻¹. MS-analysis of peptide fragments obtained from incubation of HP70 and HP70-C477 with insulin B indicated that the C-terminal domain influences the cleavage preferences of the enzyme. Washing experiments confirmed the high potential of HP70-C477 as detergent protease.
Die Anforderungen an das energiesparende Bauen sind mit der Einführung der Energieeinsparverordnung (EnEV) 2009 auch im Industrie- und Gewerbebau deutlich verschärft worden. Einen wesentlichen Beitrag zur Energieeinsparung liefert die Minimierung des Transmissionswärmetransfers. Analysiert man Gebäudehüllen in Metallleichtbauweise stellt man fest, dass eine Erhöhung der Wärmedämmstärke allein noch nicht zielführend ist, zusätzlich sind Wärmebrückeneffekte zu berücksichtigen und deren Einflüsse auf die Wärmetransmission zu reduzieren. Neben der Bedeutung für die Energieeinsparung ist eine wärmetechnisch optimierte Detailausbildung auch erforderlich, um einen ausreichenden Feuchteschutz (Vermeidung von Tauwasser und Schimmelpilz) zu realisieren und so Schäden zu vermeiden. Ein wichtiges Hilfsmittel stellt hierzu der vom Industrieverband für Bausysteme im Metallleichtbau (IFBS) herausgegebene Wärmebrückenatlas der Metall-Sandwichbauweise dar.