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b-Lactame gehören zu den wirkungsvollsten Antibiotika, jedoch lassen sich viele nur schwierig fermentativ erzeugen. Ein Problem bei der fermentativen Produktion ist die Hydrolyse des Lactamrings im wässrigen Milieu. Das Ziel des von der DBU geförderten Projekts ist die selektive In-situ-Adsorption der b-Lactamantibiotika unter anschließender magnetischer Separation. Durch die Isolation im Hochgradientenmagnetseparator (HGMS) ist eine Fest-fest-flüssig-Trennung und somit ein erheblicher Zeitgewinn im Downstreamprozess möglich. Zusätzlich kommt es zur Einsparung an Lösungsmittel und Energie, was neben Reduzierung der Antibiotikahydrolyse auch in ökologischer Hinsicht einen interessanten Aspekt darstellt. Als Trägermaterial für die Adsorbermatrix werden magnetisierbare Eisenoxidpartikel eingesetzt, die in einer Silikamatrix eingebettet sind. Diese Adsorber sollen auf Selektivität in Wasser und verschiedenen Medien getestet werden. Zusätzlich werden die Abbauprodukte des b-Lactams analysiert, um eine Aussage über die Stabilisierung des Antibiotikums durch die selektiven Adsorber treffen zu können. Diese Ergebnisse werden mit kommerziell erhältlichen Adsorbern verglichen. Die Aufreinigung der Antibiotika soll direkt aus der Fermentationsbrühe erfolgen. Um die Trennung der magnetischen, selektiven Adsorber von der Biomasse zu gewährleisten, soll der HGMS in die Fermentation integriert werden. Das filamentöse Wachstum des Mikroorganismus erfordert eine Neuauslegung der Filtermatrix.
Die wachsende Produktpalette von z. B. Pharmazeutika geht mit einer steigenden Nachfrage für hochsensitive/schonende Aufreinigungstechniken einher. Bisherige Verfahren führen oft zu geringer Reinheit und verminderter Bioaktivität, zeigen eine Limitation der Analytengröße oder bedingen dessen Modifikation. Durch die Kombination von mikroskaligen Magnetpartikeln und spezifisch wechselwirkenden Einzelstrang-DNA-Oligonukleotiden, den sog. ssDNA-Aptameren, sind eine höhere Selektivität/Reinheit und eine Automatisierung möglich. In diesem Kontext werden zum einen ssDNA-Amplifikationstechniken und zum anderen der praktische Einsatz von Aptameren in einer Magnetseparation vorgestellt. Die ssDNA-Synthese basiert auf einem In-vivo-dsDNA-Produktionsschritt mittels eines rekombinanten Escherichia coli. Die als High-copy-Plasmid organisierte Sequenz wird in vitro durch Kombination verschiedener enzymatischer Reaktionen in die funktionelle ssDNA überführt. Diese Technik bedingt nur minimale Instrumentierung bzw. Prozessregelung. Die zweite Synthesetechnik wird in Form eines In-vitro-Amplifikationsverfahrens realisiert und beruht auf dem Prinzip einer PCR (Potenzial zu einer Automatisierung bzw. Miniaturisierung). Die gewonnenen Aptamere werden im Anschluss in einem auf Magnetpartikeln basierten Trennverfahren zur Isolationvon 6xHis-tag-Proteinen bezüglich ihrer Eigenschaften untersucht.
In der Biotechnologie stellt Einzelstrang-DNA (ssDNA) eine Schlüsselrolle dar und fungiert z. B. als Baustein für die nanoskalige Feinmechanik oder als Affinitätsligand, ein sog. Aptamer. Hinsichtlich der industriellen Verwendung bieten Aptamere im Vergleich zu Antikörpern viele Vorteile, wie z. B. eine gute Renaturierung bzw. die Selektion für cytotoxische Moleküle. Aktuell wächst die Nachfrage für chimäre Aptamere von bis zu 200 n, um die simultane Bindung bzw. die Modifikation mehrerer Moleküle zu realisieren. Bis heute wird ssDNA mittels einer sequentiellen Synthese hergestellt, die eine Effizienz von ca. 99,5 % je Zyklus und bereits bei einer Produktlänge von 100 n nur noc hAusbeuten von max. 60 % zeigt. Um dem Bedarf an ssDNA im Bereich > 100 n zu entsprechen, wurden zwei enzymatische Verfahren zur Produktion dieser Makronukleotide entworfen. Die erste Technik basiert auf einerFestphasen-PCR und ermöglicht sowohlein Primer- als auch ein Templatrecycling. Das zweite Verfahren beruht auf einer Plasmidbasierten In-vivo-Amplifikation, der sog. AptaGENE®-Technologie. In einer einzigen Klonierung werden bis zu 100 Kopien des Monomers in einen Vektor kloniert. Nach einer Transformation folgt der reguläre Produktionsprozess in Form einer Kultivierung, Plasmidpräparation und sequenziellen Aufarbeitung von bis zu 6 · 10¹⁵ Makronukleotiden pro Milliliter Fermentationsvolumen.
Die selektive Isolierung von Cephalosporin C (CPC) aus komplexen Fermentationssuspensionen unter Einsatz magnetischer Separation ist das Ziel dieser Arbeit. Das Verfahren wird im frühen Stadium der Aufarbeitung genutzt, um CPC zu stabilisieren und somit die Produktausbeute zu erhöhen. Als Adsorbersysteme für CPC wurden neben einem projektinternen magnetischen Material ND 10322, dessen Oberflächenladungen spezifisch für die Bindung des Zielmoleküls synthetisiert wurden, verschiedene kommerzielle Partikelsysteme verglichen. Es konnten massenspezifische Maximalbeladungen von 51 mg g⁻¹ erreicht werden. Weiterhin wurde die Stabilität von CPC untersucht. Unter optimalen Adsorptionsbedingungen kann CPC stabilisiert werden, so dass die Geschwindigkeitskonstante der Degradation des b-Lactam-Rings unter diesen Bedingungen unter 0,005 h⁻¹ liegt. Untersuchungen zur Wiederverwertbarkeit der neuen Adsorbers zeigten eine irreversible Bindung geringer CPC-Mengen nach dem ersten Einsatz. Nach zwölf Zyklen tritt eine irreversible Bindung von CPC ein, was zu einer signifikanten Reduktion der Adsorptionsfähigkeit führt. Die Anhäufung des CPC auf dem Adsorber konnte durch IR-Untersuchungen auf die Bildung einer Peptidbindung zwischen Carboxylgruppen des CPC und Aminogruppe der Adsorberoberfläche zurückgeführt werden.
Optimierung der selektiven Aufarbeitung von Proteinen mit Aptamer-funktionalisierten Magnetpartikeln
(2012)
Die Herstellung pharmakologisch relevanter Proteine durch Mikroorganismen führt eine mehrstufige Aufarbeitung mit sich. Durch die Verwendung von Aptameren, kurzen einzelsträngigen DNA- oder RNA-Oligonukleotiden immobilisiert auf funktionalisierten, wiederverwendbaren Magnetpartikeln, können mehrere dieser Abtrennungsoperationen kombiniert und damit die Prozesskosten minimiert werden. Aufgrund der definierten dreidimensionalen Struktur können Aptamere kleine organische Moleküle hochspezifisch binden. Im vorgestellten Projekt wird die Aufarbeitung von His6-GFP als Modellprotein mithilfe der mit Aptamer funktionalisierten Magnetpartikel durchgeführt. In bisherigen Versuchen wurde die Bindung von Aptameren auf den magnetischen Partikeln sowie die Bindung des Modellproteins GFP auf den Partikeln optimiert. Des Weiteren wurden mehrere Strategien zur Elution des GFPs von den Partikeln verfolgt, um den Proteinertrag zu maximieren und die Partikel rezyklieren zu können. Die Untersuchung unspezifischer Bindungen von Zelltrümmern und Proteinen an die Magnetpartikel wurde mithilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops durchgeführt.