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Gräser sind in der Lage, einen großen Teil der für eine biobasierte Wirtschaft benötigten Biomasse zur Verfügung zustellen. Um eine ganzjährige Nutzung des Grases zu gewährleisten, muss eine stabile Lagerung des Grases erreicht werden, was z. B. durch Silieren möglich ist. Die konservierende Wirkung der Silierung beruht auf der Bildung organischer Säuren. Um diese zu gewinnen, wird die Silage gepresst, die organischen Säuren über Flüssig/Flüssig-Extraktion aus dem Presssaft abgetrenntund mittels chromatographischer Methoden weiter aufgereinigt. Im präsentierten Konzept werden die im Presskuchen enthaltenen Lignocellulosen hydrolysiert und die erhaltenen Monosaccharide zu Ethanol fermentiert. Die Phenolsäuren, die in Gräsern die Rolle des Lignins übernehmen, können simultan mit der Hydrolyse der Polysaccharide enzymatisch abgetrennt und als Nebenprodukt gewonnen werden. Die nach der Abtrennung des Ethanols verbleibenden Fermentationsreststoffe werden für die Herstellung von Biogas verwendet.
Optimierung der selektiven Aufarbeitung von Proteinen mit Aptamer-funktionalisierten Magnetpartikeln
(2012)
Die Herstellung pharmakologisch relevanter Proteine durch Mikroorganismen führt eine mehrstufige Aufarbeitung mit sich. Durch die Verwendung von Aptameren, kurzen einzelsträngigen DNA- oder RNA-Oligonukleotiden immobilisiert auf funktionalisierten, wiederverwendbaren Magnetpartikeln, können mehrere dieser Abtrennungsoperationen kombiniert und damit die Prozesskosten minimiert werden. Aufgrund der definierten dreidimensionalen Struktur können Aptamere kleine organische Moleküle hochspezifisch binden. Im vorgestellten Projekt wird die Aufarbeitung von His6-GFP als Modellprotein mithilfe der mit Aptamer funktionalisierten Magnetpartikel durchgeführt. In bisherigen Versuchen wurde die Bindung von Aptameren auf den magnetischen Partikeln sowie die Bindung des Modellproteins GFP auf den Partikeln optimiert. Des Weiteren wurden mehrere Strategien zur Elution des GFPs von den Partikeln verfolgt, um den Proteinertrag zu maximieren und die Partikel rezyklieren zu können. Die Untersuchung unspezifischer Bindungen von Zelltrümmern und Proteinen an die Magnetpartikel wurde mithilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops durchgeführt.
Glucose ist ein primäres Zwischenprodukt der Verarbeitung nachwachsender Rohstoffe, wie z. B. Cellulose. Die wertsteigernde Weiterverarbeitung des Monosaccharids erfolgt häufig in Form vonFermentationsprozessen, jedoch kann der Rohstoff auch für zahlreiche chemische Verarbeitungsstufen genutzt werden. Ein großtechnisch relevanter Prozess ist die Herstellung von Gluconsäure (GS), die u. a. als Nahrungsmittelzusatz (E 574) eingesetzt wird. Die Darstellung der Säure erfolgt durch Oxidation von Glucose mit magnetisierbarem Gold-Nano-Katalysator. Die Rückgewinnung des Katalysators aus der Reaktionslösung wurde unter Einwirkung eines Magnetfeldgradienten verwirklicht. Die Synthese der magnetischen Goldkatalysatoren (sowohl Trägerpartikel als auch Gold-Nanopartikel) wurde durch nass-chemische Fällungsreaktionen durchgeführt. Die Charakteristiken der neuen Materialen konnte durch Messungen des PCD-Potenzials, Laserbeugung und REM/EDX untersucht werden. So wurden u. a. Partikeldurchmesser von 25 lm und ein Goldgehaltvon 1,03 % ermittelt. Weiterhin wurden für die Goldkatalysatoren optimale Reaktionsbedingungen für die Glucoseoxidation im geregelten Rührkesselreaktor etabliert. Hierdurch konnten eine Produktselektivität von 100 % und eine Wiederverwendbarkeit der Partikel über mindestens zehn Zyklen erreicht werden.
Die Lösungsmittelherstellung durch Clostridien konnte wirtschaftlich nicht mit der chemischen Synthese von Lösungsmitteln auf Erdölbasis konkurrieren und wurde in den frühen 1960er Jahren nahezu vollständig eingestellt. Das Interesse an nachwachsenden Rohstoffen hat in den letzten Jahren zu einem Wiederaufleben der ABE-Fermentation geführt. Aufgrund seiner höheren Energiedichte im Vergleich zu Ethanol ist Biobutanol als Energieträgerbesonders interessant und bietet sich z. B. als Produkt einer Bioraffinerie der 2. Generation an. Für die beschriebenen Experimente wird durch das Organosolv-Verfahren aufgeschlossenes Buchenholz verwendet. Der Faserstoff wird mithilfe von CTec2-Enzymen hydrolysiert, wobei der erhaltene Überstand eine Glucosekonzentration von 66 g L⁻¹ aufweist. Auf der Basis dieses Materials können mit Clostridium acetobutylicum Butanol-Ausbeuten erzielt werden, die mit denen unter Verwendung von reinen Zuckern vergleichbar sind. Dem Problem der hohen Produktinhibierung wird mit einer In-situ-Produktaufarbeitung begegnet. Mithilfe von Lösungsmittelimprägnierten Partikeln (SIPs) kann die Produktausbeute drastisch gesteigert werden, indem die gebildeten Lösungsmittel durch das auf dem Partikel imprägnierte Lösungsmittel während der Fermentation extrahiert werden. Zudem wird hierdurch die weitere Produktaufarbeitungstark vereinfacht.
Im vom BMELV/FNR geförderten SynRg-Projekt wurde unter anderem Rapsschrot untersucht, um Polyphenole zu isolieren und aufzureinigen. Diese sollen anschließend als Basisbausteine für Polymere dienen und ihnen neuartige Eigenschaften verleihen. Derzeit wird an der Polyphenolextraktion gearbeitet, da bei organischen oder wässrigen Extraktionsprozessen überwiegend Sinapin, ein Cholinester der Sinapinsäure, vorliegt und dieses nicht für die Polymerbildung eingesetzt werden kann. Für die im Fokus stehende Sinapinsäure wird deshalb eine simultane Extraktion und enzymatische oder chemische Hydrolyse von Sinapin zu Sinapinsäure durchgeführt. Durch die Hydrolyse konnte die Sinapinsäureausbeute bereits um den Faktor 6,2 auf 15,8 mg g⁻¹ gegenüber einer reinwässrigen Extraktion gesteigert werden. Für die Aufreinigung des an Sinapinsäure reichen Extrakts erfolgt anschließend ein adsorptiver Aufarbeitungsschritt, bei dem Zeolithe zum Einsatz kommen. Mit diesem Material ist es möglich, die Sinapinsäure quantitativ zu adsorbieren und später mit 70 %igem Ethanol bei 60 °C zu desorbieren. Bei den Adsorbern handelt es sich um b-Zeolithe von der Süd-Chemie AG.
Aus hölzernen Cellulosen und Hemicellulosen können durch enzymatische Hydrolyse fermentierbare Zucker für die Herstellung von Chemikalien und Treibstoffen gewonnen werden. Die bisherige Forschung fokussiert sich oft auf die Nutzung dieser Zucker zur Gewinnung von Ethanol. Daneben muss aber auch die stoffliche Nutzung zur Gewinnung von Grundchemikalien berücksichtigt werden. Eine solche Grundchemikalie ist Itakonsäure. Obwohl die biotechnologische Itaconsäureproduktion bereits eingehend untersucht und etabliert ist, gestaltet sie sich im Rahmen von Bioraffinerien der zweiten Generation als schwierig, da der überwiegend verwendete Produktionsorganismus gegen eine weite Bandbreite von Inhibitoren sensibel ist. Die Herstellung von Itaconsäure aus Buchenholzhydrolysaten wird im Rahmen der deutschen Lignocellulose-Bioraffinerie entwickelt. Die unbehandelten Hydrolysate ermöglichen weder das Wachstum von Aspergillus terreus noch die Bildung von Itaconsäure. Daher werden Möglichkeiten zur Konditionierung des Hydrolysates mit dem Ziel einer Itaconsäureproduktion mit hohen Ausbeuten und Konzentrationen vorgestellt.
Die wachsende Produktpalette von z. B. Pharmazeutika geht mit einer steigenden Nachfrage für hochsensitive/schonende Aufreinigungstechniken einher. Bisherige Verfahren führen oft zu geringer Reinheit und verminderter Bioaktivität, zeigen eine Limitation der Analytengröße oder bedingen dessen Modifikation. Durch die Kombination von mikroskaligen Magnetpartikeln und spezifisch wechselwirkenden Einzelstrang-DNA-Oligonukleotiden, den sog. ssDNA-Aptameren, sind eine höhere Selektivität/Reinheit und eine Automatisierung möglich. In diesem Kontext werden zum einen ssDNA-Amplifikationstechniken und zum anderen der praktische Einsatz von Aptameren in einer Magnetseparation vorgestellt. Die ssDNA-Synthese basiert auf einem In-vivo-dsDNA-Produktionsschritt mittels eines rekombinanten Escherichia coli. Die als High-copy-Plasmid organisierte Sequenz wird in vitro durch Kombination verschiedener enzymatischer Reaktionen in die funktionelle ssDNA überführt. Diese Technik bedingt nur minimale Instrumentierung bzw. Prozessregelung. Die zweite Synthesetechnik wird in Form eines In-vitro-Amplifikationsverfahrens realisiert und beruht auf dem Prinzip einer PCR (Potenzial zu einer Automatisierung bzw. Miniaturisierung). Die gewonnenen Aptamere werden im Anschluss in einem auf Magnetpartikeln basierten Trennverfahren zur Isolationvon 6xHis-tag-Proteinen bezüglich ihrer Eigenschaften untersucht.
Compared with rodents and many other animal species, the human cytochrome P450 (P450) Cyp2c gene cluster varies significantly in the multiplicity of functional genes and in the substrate specificity of its enzymes. As a consequence, the use of wild-type animal models to predict the role of human CYP2C enzymes in drug metabolism and drug-drug interactions is limited. Within the human CYP2C cluster CYP2C9 is of particular importance, because it is one of the most abundant P450 enzymes in human liver, and it is involved in the metabolism of a wide variety of important drugs and environmental chemicals. To investigate the in vivo functions of cytochrome P450 Cyp2c genes and to establish a model for studying the functions of CYP2C9 in vivo, we have generated a mouse model with a deletion of the murine Cyp2c gene cluster and a corresponding humanized model expressing CYP2C9 specifically in the liver. Despite the high number of functional genes in the mouse Cyp2c cluster and the reported roles of some of these proteins in different biological processes, mice deleted for Cyp2c genes were viable and fertile but showed certain phenotypic alterations in the liver. The expression of CYP2C9 in the liver also resulted in viable animals active in the metabolism and disposition of a number of CYP2C9 substrates. These mouse lines provide a powerful tool for studying the role of Cyp2c genes and of CYP2C9 in particular in drug disposition and as a factor in drug-drug interaction.
Die selektive Isolierung von Cephalosporin C (CPC) aus komplexen Fermentationssuspensionen unter Einsatz magnetischer Separation ist das Ziel dieser Arbeit. Das Verfahren wird im frühen Stadium der Aufarbeitung genutzt, um CPC zu stabilisieren und somit die Produktausbeute zu erhöhen. Als Adsorbersysteme für CPC wurden neben einem projektinternen magnetischen Material ND 10322, dessen Oberflächenladungen spezifisch für die Bindung des Zielmoleküls synthetisiert wurden, verschiedene kommerzielle Partikelsysteme verglichen. Es konnten massenspezifische Maximalbeladungen von 51 mg g⁻¹ erreicht werden. Weiterhin wurde die Stabilität von CPC untersucht. Unter optimalen Adsorptionsbedingungen kann CPC stabilisiert werden, so dass die Geschwindigkeitskonstante der Degradation des b-Lactam-Rings unter diesen Bedingungen unter 0,005 h⁻¹ liegt. Untersuchungen zur Wiederverwertbarkeit der neuen Adsorbers zeigten eine irreversible Bindung geringer CPC-Mengen nach dem ersten Einsatz. Nach zwölf Zyklen tritt eine irreversible Bindung von CPC ein, was zu einer signifikanten Reduktion der Adsorptionsfähigkeit führt. Die Anhäufung des CPC auf dem Adsorber konnte durch IR-Untersuchungen auf die Bildung einer Peptidbindung zwischen Carboxylgruppen des CPC und Aminogruppe der Adsorberoberfläche zurückgeführt werden.
Der Erhalt möglichst hoher Zuckerkonzentrationen für nachfolgende Fermentationen und eine Steigerung der Produktivität sind Ziele der Hydrolyse bei hohen Feststoffkonzentrationen im Rahmen des Projekts „Lignocellulose Bioraffinerie“. Verwendet wird durch ein Organosolv-Verfahren aufgeschlossenes Buchenholz. Die Hydrolyse des Faserstoffes erfolgt mithilfe von CTec2-Enzymen (Fa. Novozymes). Zurzeit können unter Einsatz eines neuen Feststoffreaktors Cellulosefasern in einer Konzentration bis 400 g L⁻¹ enzymatisch hydrolysiert werden. Dabei werden Ausbeuten (g Glucose/g Cellulose im Faserstoff) bis 0,86 g g⁻¹ und Glucosekonzentrationenvon 120 g L⁻¹ erreicht. Ein Nachteil ist jedoch die hierbei auftretende Abnahme der Hydrolyseausbeuten. Zahlreiche Limitierungen bezüglich der Hydrolysierbarkeit von Lignocellulose werden zurzeit diskutiert und publiziert. Ziel der Untersuchungen ist die Identifizierung hydrolysehemmender Substanzen sowie die Erhöhung der Ausbeute an Zuckermonomeren durch den Einsatz lignolytischer Enzyme. Hierbei wird eine HPLC-MS-Methode zur Charakterisierung hemmender Substanzen eingesetzt, um potenzielle Inhibitoren zu erfassen.
Die fermentative Verwertung von Rohglycerin setzt je nach Herstellungsmethode und Produktionsorganismus eine Vorbehandlung des Glycerins zur Entfernung von Produktinhibitoren voraus. Durch den Einsatz von Hydrotalcit-Adsorbern können die im Rohglycerin enthaltenen Fettsäuren entfernt werden. Durch diese einfache Aufarbeitungsmethode ist ein mit reinem Glycerin vergleichbarer Umsatz von stark mit Fettsäuren verunreinigtem Rohglycerin zu 1,3-Propandiol (PDO) möglich. Die durch den Hydrotalcit gebundenen Fettsäuren lassen sich mit einem Ethanol-Wasser-Gemisch eluieren. Somit kann der Adsorber regeneriert und die Fettsäuren wieder der Wertschöpfungskette zugeführt werden. Im Fed-Batch-Experiment kann mit C. diolis eine PDO-Konzentration von über 50 g L⁻¹ unter Verwendung des aufgereinigten Rohglycerins erzielt werden. In der industriellen Produktion wird PDO momentan destillativ aufgearbeitet. Ein adsorptives Aufarbeitungsverfahren kann den Energiebedarf des Herstellungsprozesses drastisch senken. Auf der Suche nach einem geeigneten Material wurde ein Adsorberscreening in Bezug auf die Bindungseigenschaften durchgeführt. Mit einem b-Zeolith der Firma Süd ChemieAG konnte bisher die höchste Beladung im Modellsystem von 120 mg PDO/gAdsorber erreicht werden.
Thin films of poly(ethyleneterephthalate) [PET]were exposed to radiation dose ranging from 10 to 30 kGy by using gamma rays in the range 12.8-177.8 MGy using swift light ions of hydrogen. There was no effect of the radiation dose on the optical behaviour of PET as a result of exposure to radiation dose up to 30 kGy brought about by gamma rays but a significant decrease in the optical band gap values was observed when PET was exposed to swift light ions of hydrogen. The data obtained are discussed in terms of optical studies carried out on PET using swift heavy ions.
A large strain collection comprising antagonistic bacteria was screened for novel detergent proteases. Several strains displayed protease activity on agar plates containing skim milk but were inactive in liquid media. Encapsulation of cells in alginate beads induced protease production. Stenotrophomonas maltophilia emerged as best performer under washing conditions. For identification of wash-active proteases, four extracellular serine proteases called StmPr1, StmPr2, StmPr3 and StmPr4 were cloned. StmPr2 and StmPr4 were sufficiently overexpressed in E. coli. Expression of StmPr1 and StmPr3 resulted in unprocessed, insoluble protein. Truncation of most of the C-terminal domain which has been identified by enzyme modeling succeeded in expression of soluble, active StmPr1 but failed in case of StmPr3.
From laundry application tests StmPr2 turned out to be a highly wash-active protease at 45 °C. Specific activity of StmPr2 determined with suc-l-Ala-l-Ala-l-Pro-l-Phe-p-nitroanilide as the substrate was 17 ± 2 U/mg. In addition we determined the kinetic parameters and cleavage preferences of protease StmPr2.
A High-Throughput Functional Complementation Assay for Classification of BRCA1 Missense Variants
(2013)
Obesity-induced overexpression of miR-802 impairs glucose metabolism through silencing of Hnf1b
(2013)
Size unlimited markerless deletions by a transconjugative plasmid-system in Bacillus licheniformis
(2013)
The response of Bacillus licheniformis to heat and ethanol stress and the role of the SigB regulon
(2013)
Biotechnological downstream processing is usually an elaborate procedure, requiring a multitude of unit operations to isolate the target component. Besides the disadvantageous space-time yield, the risks of cross-contaminations and product loss grow fast with the complexity of the isolation procedure. A significant reduction of unit operations can be achieved by application of magnetic particles, especially if these are functionalized with affinity ligands. As magnetic susceptible materials are highly uncommon in biotechnological processes, target binding and selective separation of such particles from fermentation or reactions broths can be done in a single step. Since the magnetizable particles can be produced from iron salts and low priced polymers, a single-use implementation of these systems is highly conceivable. In this article, the principles of magnetizable particles, their synthesis and functionalization are explained. Furthermore, applications in the area of reaction engineering, microfluidics and downstream processing are discussed focusing on established single-use technologies and development potential.
Living cells are complex biological systems transforming metabolites taken up from the surrounding medium. Monitoring the responses of such cells to certain substrate concentrations is a challenging task and offers possibilities to gain insight into the vitality of a community influenced by the growth environment. Cell-based sensors represent a promising platform for monitoring the metabolic activity and thus, the “welfare” of relevant organisms. In the present study, metabolic responses of the model bacterium Escherichia coli in suspension, layered onto a capacitive field-effect structure, were examined to pulses of glucose in the concentration range between 0.05 and 2 mM. It was found that acidification of the surrounding medium takes place immediately after glucose addition and follows Michaelis–Menten kinetic behavior as a function of the glucose concentration. In future, the presented setup can, therefore, be used to study substrate specificities on the enzymatic level and may as well be used to perform investigations of more complex metabolic responses. Conclusions and perspectives highlighting this system are discussed.
Commercial materials with polyvinylpolypyrrolidone and polymeric amberlites (XAD7HP, XAD16) are commonly used for the adsorptive downstream processing of polyphenols from renewable resources. In this study, beta-zeolite-based adsorbent systems were examined, and their properties were compared to organic resins. Batch adsorption experiments were conducted with synthetic solutions of major polyphenols. Adsorption isotherms and desorption characteristics of individual adsorbent were determined based on these results. Maximum adsorption capacities were calculated using the Langmuir model. For example, the zeolites had capacities up to 203.2 mg/g for ferulic acid. To extend these results to a complex system, additional experiments were performed on rapeseed meal and wheat seed extracts as representative renewable resources. HPLC analysis showed that with 7.5% w/v, which is regarded as the optimum amount of zeolites, zeolites A and B could bind 100% of the major polyphenols as well as release polyphenols at high yields. Additionally, regeneration experiments were performed with isopropyl alcohol at 99°C to evaluate how zeolites regenerate under mild conditions. The results showed only a negligible loss of adsorption capacity and no loss of desorption capacity. In summary, it was concluded that beta-zeolites were promising adsorbents for developing new processes to isolate polyphenols from renewable resources.
A microfluidic chip integrating amperometric enzyme sensors for the detection of glucose, glutamate and glutamine in cell-culture fermentation processes has been developed. The enzymes glucose oxidase, glutamate oxidase and glutaminase were immobilized by means of cross-linking with glutaraldehyde on platinum thin-film electrodes integrated within a microfluidic channel. The biosensor chip was coupled to a flow-injection analysis system for electrochemical characterization of the sensors. The sensors have been characterized in terms of sensitivity, linear working range and detection limit. The sensitivity evaluated from the respective peak areas was 1.47, 3.68 and 0.28 μAs/mM for the glucose, glutamate and glutamine sensor, respectively. The calibration curves were linear up to a concentration of 20 mM glucose and glutamine and up to 10 mM for glutamate. The lower detection limit amounted to be 0.05 mM for the glucose and glutamate sensor, respectively, and 0.1 mM for the glutamine sensor. Experiments in cell-culture medium have demonstrated a good correlation between the glutamate, glutamine and glucose concentrations measured with the chip-based biosensors in a differential-mode and the commercially available instrumentation. The obtained results demonstrate the feasibility of the realized microfluidic biosensor chip for monitoring of bioprocesses.
The invention relates to a system for the implementation of chemical, biological or physical reactions, consisting of - one or more magnetic micro-reactors, each comprising a shell made of hydrophobic magnetic nanoparticles encapsulating an aqueous core, - a plane platform comprising a surface to receive the micro-reactors, - a source that generates a magnetic field above or underneath the platform for manipulating the one or more hydrophobic magnetic micro-reactors, or for moving them along the surface of the platform from one position to another position, characterized in that the aqueous core of the one or more magnetic micro-reactors contains a reaction solution or buffer, and wherein the magnetic field generated by the source correlates to a defined position on the surface of the platform.
Biopharmaceuticals such as antibodies are produced in cultivated mammalian cells, which must be monitored to comply with good manufacturing practice. We, therefore, developed a fully automated system comprising a specific exhaust gas analyzer, inline analytics and a corresponding algorithm to precisely determine the oxygen uptake rate, carbon dioxide evolution rate, carbon dioxide transfer rate, transfer quotient and respiratory quotient without interrupting the ongoing cultivation, in order to assess its reproducibility. The system was verified using chemical simulation experiments and was able to measure the respiratory activity of hybridoma cells and DG44 cells (derived from Chinese hamster ovary cells) with satisfactory results at a minimum viable cell density of ~2.0 × 10⁵ cells ml⁻¹. The system was suitable for both batch and fed-batch cultivations in bubble-aerated and membrane-aerated reactors, with and without the control of pH and dissolved oxygen.
Poly(vinyl acetate), PVAc, with a degree of polymerization Xn = 10 was prepared by chain-transfer radical polymerization using carbon tetrachloride and used as oligomeric plasticizer for commercial PVAc. However, the chlorinated chain ends cause a low thermal stability requiring mild Cl/H substitution. The product exhibits high thermal stability and excellent melt-compounding properties. Blends of oligomeric and commercial PVAc show single glass transition temperatures which decrease with higher oligomer content and exhibit small negative deviations from Fox' linear additivity rule. This indicates plasticization and miscibility being mainly due to entropic effects. Injection-moulded thick specimens show ductile behaviour at oligomer contents >10 wt %, while sheets with a thickness of 0.2–0.5 mm appear flexible already at 7.5 wt %. The oxygen permeability coefficients are an order of magnitude lower than those of low-density polyethylene. Due to the sum of their properties, the plasticized sheets present a promising alternative in the preparation of barrier materials.
The composition and physiochemical properties of aquatic-phase natural organic matter (NOM) are most important problems for both environmental studies and water industry. Laser desorption/ionization (LDI) mass spectrometry facilitated successful examinations of NOM, as humic and fulvic acids in NOM are readily ionized by the nitrogen laser. In this study, hydrophobic NOMs (HPO NOMs) from river, reservoir and waste water were characterized by this technique. The effect of analytical variables like concentration, solvent composition and laser energy was investigated. The exact masses of small molecular NOM moieties in the range of 200–1200 m/z were determined in reflectron mode. In addition, spectra of post-source-decay experiments in this range showed that some compounds from different natural NOMs had the same fragmental ions. In the large mass range of 1200–15 000 Da, macromolecules and their aggregates were found in HPO NOMs from natural waters. Highly humic HPO exhibited mass peaks larger than 8000 Da. On the other hand, the waste water and reservoir water mainly had relatively smaller molecules of about 2000 Da. The LDI-MS measurements indicated that highly humic river waters were able to form large aggregates and membrane foulants, while the HPO NOMs from waste water and reservoir water were unlikely to form large aggregates. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.
Clostridium propionicum is the only organism known to ferment β-alanine, a constituent of coenzyme A (CoA) and the phosphopantetheinyl prosthetic group of holo-acyl carrier protein. The first step in the fermentation is a CoA-transfer to β-alanine. Subsequently, the resulting β-alanyl-CoA is deaminated by the enzyme β-alanyl-CoA:ammonia lyase (Acl) to reversibly form ammonia and acrylyl-CoA. We have determined the crystal structure of Acl in its apo-form at a resolution of 0.97 Å as well as in complex with CoA at a resolution of 1.59 Å. The structures reveal that the enyzme belongs to a superfamily of proteins exhibiting a so called “hot dog fold” which is characterized by a five-stranded antiparallel β-sheet with a long α-helix packed against it. The functional unit of all “hot dog fold” proteins is a homodimer containing two equivalent substrate binding sites which are established by the dimer interface. In the case of Acl, three functional dimers combine to a homohexamer strongly resembling the homohexamer formed by YciA-like acyl-CoA thioesterases. Here, we propose an enzymatic mechanism based on the crystal structure of the Acl·CoA complex and molecular docking. Proteins 2014; 82:2041–2053. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.
The metabolic activity of Chinese hamster ovary (CHO) cells was observed using a light-addressable potentiometric sensor (LAPS). The dependency toward different glucose concentrations (17–200 mM) follows a Michaelis–Menten kinetics trajectory with Kₘ = 32.8 mM, and the obtained Kₘ value in this experiment was compared with that found in literature. In addition, the pH shift induced by glucose metabolism of tumor cells transfected with the HPV-16 genome (C3 cells) was successfully observed. These results indicate the possibility to determine the tumor cells metabolism with a LAPS-based measurement device.
The light-addressable potentiometric sensor (LAPS) is a semiconductor-based potentiometric sensor using a light probe with an ability of detecting the concentration of biochemical species in a spatially resolved manner. As an important biomedical sensor, research has been conducted to improve its performance, for instance, to realize high-speed measurement. In this work, the idea of facilitating the device-level simulation, instead of using an equivalent-circuit model, is presented for detailed analysis and optimization of the performance of the LAPS. Both carrier distribution and photocurrent response have been simulated to provide new insight into both amplitude-mode and phase-mode operations of the LAPS. Various device parameters can be examined to effectively design and optimize the LAPS structures and setups for enhanced performance.
Technische Cellulose wurde als möglicher Rohstoff zur fermentativen Produktbildung untersucht. Hierfür wird Cellulose in der Lignocellulose-Bioraffinerie hergestellt und daraus Hydrolysat gewonnen. Die Prüfung der technischen Hydrolysate als Substrate erfolgte anhand eines breiten Spektrums an Bioprodukten, von Kraftstoffen wie Ethanolund Butanol, bis zu den Dicarbonsäuren Itacon- und Bernsteinsäure. Dabei werden Bakterien, Hefen und Pilze als Produktionsorganismen eingesetzt. Die einzelnen Herstellverfahren stellen unterschiedliche Anforderungen an die Substrathandhabung. Im Fall der Ethanol- und Butanol-Gewinnung kann eine simultane Saccharifizierung und Fermentierung (SSF) durchgeführt werden. Aufgrund der Produkttoxizität erfordert die Butanol-Herstellung dabei eine In-situ-Produktabtrennung durch Lösemittelimprägnierte Partikel. Die Herstellung der beiden Dicarbonsäuren unterscheidet sich in der Sensitivität der verwendeten Mikroorganismen gegenüber Inhibitoren, die in Spuren im Hydrolysat enthalten sind. Die Bernteinsäurebildung mit Actinobacillussuccinogenes kann mit unbehandeltem Hydrolysat erfolgen. Dagegen erfordert die Gewinnung von Itaconsäure mit A. terreus eine Detoxifizierung des Hydrolysats. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sämtliche Bioraffinerie-Hydrolysate als Substrate für unterschiedliche Fermentationen geeignet sind.
Bacillus pumilus reveals a remarkably high resistance to hydrogen peroxide provoked oxidative stress
(2014)
Bacillus pumilus is characterized by a higher oxidative stress resistance than other comparable industrially relevant Bacilli such as B. subtilis or B. licheniformis. In this study the response of B. pumilus to oxidative stress was investigated during a treatment with high concentrations of hydrogen peroxide at the proteome, transcriptome and metabolome level. Genes/proteins belonging to regulons, which are known to have important functions in the oxidative stress response of other organisms, were found to be upregulated, such as the Fur, Spx, SOS or CtsR regulon. Strikingly, parts of the fundamental PerR regulon responding to peroxide stress in B. subtilis are not encoded in the B. pumilus genome. Thus, B. pumilus misses the catalase KatA, the DNA-protection protein MrgA or the alkyl hydroperoxide reductase AhpCF. Data of this study suggests that the catalase KatX2 takes over the function of the missing KatA in the oxidative stress response of B. pumilus. The genome-wide expression analysis revealed an induction of bacillithiol (Cys-GlcN-malate, BSH) relevant genes. An analysis of the intracellular metabolites detected high intracellular levels of this protective metabolite, which indicates the importance of bacillithiol in the peroxide stress resistance of B. pumilus.
Developing a new production host from a blueprint: Bacillus pumilus as an industrial enzyme producer
(2014)
1. Drug metabolizing enzymes and transporters play important roles in the absorption, metabolism, tissue distribution and excretion of various compounds and their metabolites and thus can significantly affect their efficacy and safety. Furthermore, they can be involved in drug–drug interactions which can result in adverse responses, life-threatening toxicity or impaired efficacy. Significant species differences in the interaction of compounds with drug metabolizing enzymes and transporters have been described.
2. In order to overcome the limitation of animal models in accurately predicting human responses, a large variety of mouse models humanized for drug metabolizing enzymes and to a lesser extent drug transporters have been created.
3. This review summarizes the literature describing these mouse models and their key applications in studying the role of drug metabolizing enzymes and transporters in drug bioavailability, tissue distribution, clearance and drug–drug interactions as well as in human metabolite testing and risk assessment.
4. Though such humanized mouse models have certain limitations, there is great potential for their use in basic research and for testing and development of new medicines. These limitations and future potentials will be discussed.
Molecular Modeling Approach to the Prediction of Mechanical Properties of Silica-Reinforced Rubbers
(2014)
Recently, we have suggested a nanomechanical model for dissipative loss in filled elastomer networks in the context of the Payne effect. The mechanism is based on a total interfiller particle force exhibiting an intermittent loop, due to the combination of short-range repulsion and dispersion forces with a long-range elastic attraction. The sum of these forces leads, under external strain, to a spontaneous instability of “bonds” between the aggregates in a filler network and attendant energy dissipation. Here, we use molecular dynamics simulations to obtain chemically realistic forces between surface modified silica particles. The latter are combined with the above model to estimate the loss modulus and the low strain storage modulus in elastomers containing the aforementioned filler-compatibilizer systems. The model is compared to experimental dynamic moduli of silica filled rubbers. We find good agreement between the model predictions and the experiments as function of the compatibilizer's molecular structure and its bulk concentration.
The Gram-positive endospore-forming bacterium Bacillus licheniformis can be found widely in nature and it is exploited in industrial processes for the manufacturing of antibiotics, specialty chemicals, and enzymes. Both in its varied natural habitats and in industrial settings, B. licheniformis cells will be exposed to increases in the external osmolarity, conditions that trigger water efflux, impair turgor, cause the cessation of growth, and negatively affect the productivity of cell factories in biotechnological processes. We have taken here both systems-wide and targeted physiological approaches to unravel the core of the osmostress responses of B. licheniformis. Cells were suddenly subjected to an osmotic upshift of considerable magnitude (with 1 M NaCl), and their transcriptional profile was then recorded in a time-resolved fashion on a genome-wide scale. A bioinformatics cluster analysis was used to group the osmotically up-regulated genes into categories that are functionally associated with the synthesis and import of osmostress-relieving compounds (compatible solutes), the SigB-controlled general stress response, and genes whose functional annotation suggests that salt stress triggers secondary oxidative stress responses in B. licheniformis. The data set focusing on the transcriptional profile of B. licheniformis was enriched by proteomics aimed at identifying those proteins that were accumulated by the cells through increased biosynthesis in response to osmotic stress. Furthermore, these global approaches were augmented by a set of experiments that addressed the synthesis of the compatible solutes proline and glycine betaine and assessed the growth-enhancing effects of various osmoprotectants. Combined, our data provide a blueprint of the cellular adjustment processes of B. licheniformis to both sudden and sustained osmotic stress.
Members of the species Bacillus pumilus get more and more in focus of the biotechnological industry as potential new production strains. Based on exoproteome analysis, B. pumilus strain Jo2, possessing a high secretion capability, was chosen for an omics-based investigation. The proteome and metabolome of B. pumilus cells growing either in minimal or complex medium was analyzed. In total, 1542 proteins were identified in growing B. pumilus cells, among them 1182 cytosolic proteins, 297 membrane and lipoproteins and 63 secreted proteins. This accounts for about 43% of the 3616 proteins encoded in the B. pumilus Jo2 genome sequence. By using GC–MS, IP-LC/MS and H NMR methods numerous metabolites were analyzed and assigned to reconstructed metabolic pathways. In the genome sequence a functional secretion system including the components of the Sec- and Tat-secretion machinery was found. Analysis of the exoproteome revealed secretion of about 70 proteins with predicted secretion signals. In addition, selected production-relevant genome features such as restriction modification systems and NRPS clusters of B. pumilus Jo2 are discussed.
The development of a cost-effective hydrolysis for crude cellulose is an essential part of biorefinery developments. To establish such high solid hydrolysis, a new solid state reactor with static mixing is used. However, concentrations >10% (w/w) cause a rate and yield reduction of enzymatic hydrolysis. By optimizing the synergetic activity of cellulolytic enzymes at solid concentrations of 9%, 17% and 23% (w/w) of crude Organosolv cellulose, glucose concentrations of 57, 113 and 152 g L⁻¹ are reached. However, the glucose yield decreases from 0.81 to 0.72gg⁻¹ at 17% (w/w). Optimal conditions for hydrolysis scale-up under minimal enzyme addition are identified. As result, at 23% (w/w) crude cellulose the glucose yield increases from 0.29 to 0.49gg⁻¹. As proof of its applicability, biobutanol, succinic and itaconic acid are produced with the crude hydrolysate. The potential of the substrate is proven e.g. by a high butanol yield of 0.33gg⁻¹.
A major part of edible oil is subjected to bleaching procedures, primarily with minerals applied as adsorbers. Their recycling is currently done either by regaining the oil via organic solvent extraction or by using the spent bleaching earth (SBE) as additive for animal feed, etc. As a new method, the reutilization of the by-product SBE for the microbiologic formation of acetone, butanol, and ethanol (ABE) is presented as proof-of-concept. The SBE was taken from a palm oil cleaning process. The recycling concept is based on the application of lipolytic clostridia strains. Due to considerably long fermentation times, co-fermentation with Candida rugosa and enzymatic hydrolyses of the bound oil with a subsequent clostridia fermentation are shown as alternative routes. Anaerobic fermentations under comparison of different clostridia strains were performed with glycerol media, enzymatically hydrolyzed palm oil and SBE. Solutes, side product compositions and productivities were quantified via HPLC. A successful production of ABE solutes from SBE has been done with a yield of 0.15 g butanol per gram of bound glycerol. Thus, the biotechnological recycling of the waste stream is possible in principle. Inhibition of the substrate suspension has been observed. A chromatographic ion-exchange of substrates increased the biomass concentration.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung des Kontaktwinkels eines flüssigen oder mit Flüssigkeit gefüllten Körpers. Dieser besteht aus einem Träger (1) und einer damit verbundenen, in einem Winkelbereich von mehr als 0° bis maximal 90° neigbaren Ebene (8) mit einer darin ausgebildeten Abrollbahn (9) für den flüssigen oder mit Flüssigkeit gefüllten Körper. An der Ebene (8) sind mehrere Sensoren (11, 12) zur Erfassung der Rolldauer des Körpers entlang der Rollstrecke angeordnet. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Einstellung des Neigungswinkels der Ebene (8) über ein Winkelmessgerät (10) erfolgt, wodurch ein Abrollwinkel erfassbar ist, bei dem der Körper in Bewegung gerät. Aus der Rolldauer, der Rollstrecke und dem Abrollwinkel wird der Kontaktwinkel des Körpers ermittelt.
Organic anion transporting polypeptide (Oatp) 1a/1b knockout and OATP1B1 and -1B3 humanized mouse models are promising tools for studying the roles of these transporters in drug disposition. Detailed characterization of these models will help to better understand their utility for predicting clinical outcomes. To advance this approach, we carried out a comprehensive analysis of these mouse lines by evaluating the compensatory changes in mRNA expression, quantifying the amounts of OATP1B1 and -1B3 protein by liquid chromatography–tandem mass spectrometry, and studying the active uptake in isolated hepatocytes and the pharmacokinetics of some prototypical substrates including statins. Major outcomes from these studies were 1) mostly moderate compensatory changes in only a few genes involved in drug metabolism and disposition, 2) a robust hepatic expression of OATP1B1 and -1B3 proteins in the respective humanized mouse models, and 3) functional activities of the human transporters in hepatocytes isolated from the humanized models with several substrates tested in vitro and with pravastatin in vivo. However, the expression of OATP1B1 and -1B3 in the humanized models did not significantly alter liver or plasma concentrations of rosuvastatin and pitavastatin compared with Oatp1a/1b knockout controls under the conditions used in our studies. Hence, although the humanized OATP1B1 and -1B3 mice showed in vitro and/or in vivo functional activity with some statins, further characterization of these models is required to define their potential use and limitations in the prediction of drug disposition and drug-drug interactions in humans.
Die Nutzung von Biomasse aus pflanzlichen Abfällen für die stoffliche Verwertung rückt immer stärker in den Vordergrund. Dabei ist vor allem die ganzheitliche Verwertung der Stoffströme von Bedeutung, da diese einen integrativen Ansatz ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Produktion von Einzellerproteinen (Single-Cell Proteins, SCPs) mithilfe von unterschiedlichen Rohsubstraten dargelegt. Somit können Reststoffströme, die in keiner Konkurrenz zur Produktion von Lebensmitteln stehen, für die Herstellung von Futter- und auch Nahrungsmitteln Verwendung finden. Die zunächst thermisch vorbehandelten Ausgangsmaterialien stammen aus forstwirtschaftlichen und grünen Abfällen und ermöglichen durch eine anschließende enzymatische Hydrolyse die Freisetzung von Monosacchariden. Aus diesen erfolgt die SCP-Produktion fermentativ mithilfe der drei Modellorganismen Bakterium, Hefe und Pilz. Hierfür wird sowohl das flüssige Hydrolysat als auch der feste Reststoff auf der Basis einer Feststofffermentation genutzt. Auf diese Weise ist eine vollständige Verwertung der Ausgangsmaterialien möglich. Mit den gewonnen Daten erfolgt abschließend eine Bewertung der SCPs aus nachwachsenden Rohstoffen als alternative Proteinquelle.
Primäre Ziele der Hydrolyse pflanzlicher nachwachsender Rohstoffe sind möglichst hohe Zuckerkonzentrationen für nachfolgende Fermentationen und eine Maximierung der Produktivität. Zur Optimierung dieser Prozesse wird Organosolv-aufgeschlossene Buchenholz-Cellulose verwendet. Die Hydrolyse des Faserstoffes erfolgt mithilfe von Novozymes CTec2-Enzymen. Die Hydrolysen konnten durch neue Rührerelemente auf einen Maßstab von 1000 L übertragen werden. Dabei konnten maximale Ausbeuten (g Glucose g –1 Glucose im Faserstoff) bis 81 g g – 1 und Konzentrationen von 152 g L –1 erreicht werden. Zurzeit können unter Einsatz eines Feststoffreaktors Cellulosefasern in einer Konzentration bis 400 g L –1 enzymatisch hydrolysiert werden. Die cellulolytischen Enzyme stoßen bei hohen Feststoffkonzentrationen an ihre Grenzen. Mit steigendem Feststoffgehalt nimmt die Hydrolyseausbeute ab. Ein Ansatz zur Steigerung der Effizienz ist der Einsatz ligninolytischer Enzyme, die Ligninreste an der Organosolv-Cellulose aufschließen können. Eine solche Verbesserung der Zugänglichkeit für cellulolytische Enzyme an ihr Substrat wurde durch Kulturüberstände verschiedener ligninolytischer Pilze erreicht. Mit Kulturüberständen von Stereum sp. sind Steigerungen der Glucoseausbeuten um bis zu 30 % möglich.
Einige Arten der Braun- und Weißfäulepilze sind in der Lage, selektiv entweder Lignin oder Cellulose im Holz abzubauen. Diese Pilze können für eine energiesparende Vorbehandlung lignocellulosehaltiger Biomasse für Bioraffinerien genutzt werden, ohne auf technisch aufwändige Aufschlussapparate zurückgreifen zu müssen. Weißfäulepilze bauen bevorzugt Lignin ab, wodurch die verbleibende Cellulose leichter für enzymatische Hydrolysen in das Monosaccharid Glucose zugänglich wird. Braunfäulepilze bauen dagegen Cellulose und Hemicellulose ab. Die Auswirkungen der Behandlung von Weizenstroh mit verschiedenen Pilzarten werden zurzeit untersucht. Dabei werden die Veränderung der enzymatischen Hydrolysierbarkeit des Substrats sowie die gebildeten Ligninderivate bestimmt. Detaillierte Betrachtungen der Biomasseveränderung werden mithilfe spezifischer Färbemethoden durchgeführt, durch die morphologische Veränderungen der Pflanzengewebe in der 3D-Lichtmikroskopie dargestellt werden können.
Aktiver und passiver antimikrobieller Oberflächenschutz durch funktionalisierte Mikropartikel
(2014)
Mikrobielle Verunreinigungen von Oberflächen in technischen und medizinischen Systemen sind allgegenwärtig. Sie basieren üblicherweise auf adsorptiven Oberflächenbindungen organischer Komponenten (Proteine und Fette) oder Membrankomponenten aerogener sowie wassergebundener Mikroorganismen. In laufenden Forschungsarbeiten wird eine aktive sowie passive Biomodifikation von Oberflächen zu deren Schutz vor Adsorption von Proteinen und Mikroorganismen verfolgt. Der antimikrobielle Schutz soll dabei sowohl durch die Mikrostrukturierung bzw. Rauheitsanpassung der Oberflächen durch deren Beschichtung mit Mikro-und Nanopartikeln erfolgen. Ferner werden antimikrobielle Enzyme und funktionelle Gruppen auf den Mikropartikeln gebunden, um den Oberflächenschutz zu verstärken. In ersten Versuchen wurden quartäre Ammoniumverbindungen auf eigens synthetisierten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (Durchmesser 10 – 30 nm) immobilisiert und die wachstumshemmende Wirkung untersucht. Erste Ergebnisse zeigten, dass eine Konzentration von 10 mg mL⁻¹ der Ammoniumverbindung in einer Wachstumshemmung des verwendeten Gram-negativen Modell-Mikroorganismus E. coli GFPmut2 resultiert. Zurzeit werden synergistisch wirkende Kombinationen von Partikeln mit Proteasen, quartären Ammoniumverbindungen, hydrophoben Oberflächen und mikrostrukturierten Oberflächen als antimikrobieller Schutz untersucht.
In der Reihe der nachwachsenden Rohstoffe besitzt Holz als erneuerbare und umweltfreundliche Ressource ein großes Potenzial. Über 11 Mio. ha Holz, das laut der Fachagentur für nachwachsende Rohstoffe (FNR) auch für industrielle Zwecke genutzt werden kann, wuchsen im Jahr 2013 allein auf bundesdeutscher Fläche. 56,8 Mio. m³ jährlicher Holzeinschlag in den letzten zehn Jahren wurde zu knapp der Hälfte stofflich und der Rest energetisch verwertet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auf der Basis vom Holz der Buche, die nach Fichte und Kiefer die dritthäufigste Baumart in Deutschland ist und 15% der deutschen Waldfläche ausmacht, die Fraktionierung der polymeren Hauptbestandteile mit niedrigem energetischen Einsatz erreicht werden. Hierbei werden in einem nachgeschalteten Extraktionsprozess die beiden Komponenten Hemicellulose und Lignin in flüssiger Form von der finalen festen Cellulosefraktion abgetrennt. Die Extraktion der Hemicellulose erfolgt durch eine Liquid Hot Water (LHW)-Behandlung. Untersucht wird der katalytische Zusatz anorganischer Säuren wie H₃PO₄ und H₂SO₄. Im Hinblick auf die weitere Verwertung von Lignin zu aromatischen Synthesebausteinen kommt die Organosolv-Extraktion mit einem Ethanol/Wasser-Gemisch zum Einsatz. Von Vorteil ist die weitere Verwendung beider Stoffströme ohne Fällungsschritt und nachteiliger Verdünnung der Hemicellulose.
Biotechnologie und die mit ihr verbundenen technischen Prozesse prägen seit Jahrtausenden die Entwicklung der Menschheit. Ausgehend von empirischen Verfahren, insbesondere zur Herstellung von Lebensmitteln und täglichen Gebrauchsgütern, haben sich diese Disziplinen zu einem der innovativsten Zukunftsfelder entwickelt. Durch das immer detailliertere Verständnis zellulärer Vorgänge können mittlerweile Produktionsstämme gezielt optimiert werden. Im Zusammenspiel mit moderner Prozesstechnik können so eine Vielzahl von Bulk- und Feinchemikalien sowie Pharmazeutika effizient hergestellt werden. In diesem Artikel werden exemplarisch einige der aktuellen Trends vorgestellt.
High gradient magnetic separation (HGMS) has been established since the early 1970s. A more recent application of these systems is the use in bioprocesses. To integrate the HGMS in a fermentation process, it is necessary to optimize the separation matrix with regard to the magnetic separation characteristics and permeability of the non-magnetizable components of the fermentation broth. As part of the work presented here, a combined fluidic and magnetic force finite element model simulation was created using the software COMSOL Multiphysics and compared with separation experiments. Finally, as optimal lattice orientation of the separation matrix, a transversal rhombohedral arrangement was defined. The high suitability of the new filter matrix has been verified by separation experiments.
In diesem Beitrag wird die NIR- und MIR-Spektrometrie in Kombination mit multivariaten Kalibrationsmodellen zur Analyse von Monosacchariden und Cellulose aus Biomasse etabliert. Spektrengemischter Standardlösungen mit definierten Glucose- und Xylosekonzentrationen in Wasser werden im NIR-(Lambda 750, Perkin Elmer, USA) und MIR-Bereich (Spektrum 100, PerkinElmer) in Gegenwart von entweder Carboxymethylcellulose oder Grasfasern aufgenommen. Darauf basierend werden Kalibrationsmodelle (Unscrambler®, CAMO-Software AS, Norwegen) entwickelt und zur Vorhersage der Zuckerkonzentration in den Hydrolyseproben und der Celluloseanteile angewendet. Darüber hinaus wird die Partikelgröße der Rohstoffe bestimmt. Die Messergebnisse bilden die experimentelle Basis für die numerische Modellierung der Reaktionskinetik der enzymatischen Hydrolyse von Lignocellulose. Das Modell kombiniert die Bilanzierung der Partikelgrößenverteilungen mit der Multienzymkinetik. Dabei werden neben der Partikelgrößenverteilung und der Substratkonzentration die Zusammensetzung der Rohstoffe nach Vorbehandlung sowie die Produktinhibierung und mehrere enzymatische Aktivitäten berücksichtigt. Das Modell ermöglicht es, die Partikelgrößenverteilungen und die Konzentrationen der Substrate und Produkte während der Hydrolyse vorherzusagen und die kinetischen Parameter im Batch- sowie im Fed-Batch-Reaktor zu bestimmen.
The constitutive androstane receptor (CAR) and the pregnane X receptor (PXR) are closely related nuclear receptors involved in drug metabolism and play important roles in the mechanism of phenobarbital (PB)-induced rodent nongenotoxic hepatocarcinogenesis. Here, we have used a humanized CAR/PXR mouse model to examine potential species differences in receptor-dependent mechanisms underlying liver tissue molecular responses to PB. Early and late transcriptomic responses to sustained PB exposure were investigated in liver tissue from double knock-out CAR and PXR (CARᴷᴼ-PXRᴷᴼ), double humanized CAR and PXR (CARʰ-PXRʰ), and wild-type C57BL/6 mice. Wild-type and CARʰ-PXRʰ mouse livers exhibited temporally and quantitatively similar transcriptional responses during 91 days of PB exposure including the sustained induction of the xenobiotic response gene Cyp2b10, the Wnt signaling inhibitor Wisp1, and noncoding RNA biomarkers from the Dlk1-Dio3 locus. Transient induction of DNA replication (Hells, Mcm6, and Esco2) and mitotic genes (Ccnb2, Cdc20, and Cdk1) and the proliferation-related nuclear antigen Mki67 were observed with peak expression occurring between 1 and 7 days PB exposure. All these transcriptional responses were absent in CARᴷᴼ-PXRᴷᴼ mouse livers and largely reversible in wild-type and CARʰ-PXRʰ mouse livers following 91 days of PB exposure and a subsequent 4-week recovery period. Furthermore, PB-mediated upregulation of the noncoding RNA Meg3, which has recently been associated with cellular pluripotency, exhibited a similar dose response and perivenous hepatocyte-specific localization in both wild-type and CARʰ-PXRʰ mice. Thus, mouse livers coexpressing human CAR and PXR support both the xenobiotic metabolizing and the proliferative transcriptional responses following exposure to PB.
Biotechnologische Wertstoffgewinnung entlang der Prozessketten Grüner und Pflanzenöl-Bioraffinerien
(2014)
Der nachwachsende Rohstoff Raps ist in großen Mengen verfügbar und eine Quelle für Biomoleküle mit hohem Wertschöpfungspotenzial. Entwicklungen zur biotechnologischen Wertstoffgewinnung werden dabei schwerpunktmäßig in den Bereichen Aufarbeitung und Funktionalisierung von Polyphenolen und Fetten betrieben. Bei der Verarbeitung der Pflanzenmaterialien werden dabei insbesondere Verfahren zur adsorptiven Aufreinigung und Auftrennung mittels Materialien mit modifizierten Bleicherden und anderen organischen oder anorganischen Adsorbentien untersucht. Ferner wurden für die Aufreinigung von Polyphenolen adsorptive sowie extraktive Prozesse entwickelt. Bei den Entwicklungen wird berücksichtigt, dass Bioraffinerien auf eine fortwährende Gewährleistung eines hohen Produktions- bzw. Lieferbedarfs nachwachsender Rohstoffe angewiesen sind. Somit werden Optionen dezentraler regionaler Vorbehandlungs- und Wertschöpfungsketten in der Nähe landwirtschaftlicher Betriebe einbezogen. Neben neuen Aufreinigungsverfahren werden mikrobielle und enzymatische Prozesse zur wertsteigernden Umsetzung von Glycerin, Polyphenolen und Zuckermonomeren vorgestellt sowie Limitierungen nachwachsender Rohstoffe der 2. Generation diskutiert.
In humans, 75% of all drugs are metabolized by the cytochrome P450-dependent monooxygenase system. Enzymes encoded by the CYP2C, CYP2D, and CYP3A gene clusters account for ∼80% of this activity. There are profound species differences in the multiplicity of cytochrome P450 enzymes, and the use of mouse models to predict pathways of drug metabolism is further complicated by overlapping substrate specificity between enzymes from different gene families. To establish the role of the hepatic and extrahepatic P450 system in drug and foreign chemical disposition, drug efficacy, and toxicity, we created a unique mouse model in which 30 cytochrome P450 genes from the Cyp2c, Cyp2d, and Cyp3a gene clusters have been deleted. Remarkably, despite a wide range of putative important endogenous functions, Cyp2c/2d/3a KO mice were viable and fertile, demonstrating that these genes have evolved primarily as detoxification enzymes. Although there was no overt phenotype, detailed examination showed Cyp2c/2d/3a KO mice had a smaller body size (15%) and larger livers (20%). Changes in hepatic morphology and a decreased blood glucose (30%) were also noted. A five-drug cocktail of cytochrome P450 isozyme probe substrates were used to evaluate changes in drug pharmacokinetics; marked changes were observed in either the pharmacokinetics or metabolites formed from Cyp2c, Cyp2d, and Cyp3a substrates, whereas the metabolism of the Cyp1a substrate caffeine was unchanged. Thus, Cyp2c/2d/3a KO mice provide a powerful model to study the in vivo role of the P450 system in drug metabolism and efficacy, as well as in chemical toxicity.
Die Teilefertigung durch Rapid Prototyping (RP) verkürzt den Weg von der Idee bis zum Produkt, wobei unter anderem Optimierungszyklen in geringer Zeit durchlaufen werden können. Ferner eröffnen neue Entwicklungen in diesem Bereich die Möglichkeit individueller Produktionsverfahren. Im Unterschied zur klassischen Fertigung von Prototypen wird beim RP mit additiver Schichtfertigung (Additive Layer Manufacturing, ALM) gearbeitet. Je nach Methode werden Flüssigkeiten oder Pulver nach Vorgaben eines 3D-Computermodells sequentiell aufgetragen. Diese Verfahren existieren seit ca. 25 Jahren, jedoch sind seit kurzem ausgesprochen günstige Geräte verfügbar, die Objekte mit Genauigkeiten bis 20 lm fertigen können. Das RP hat in klinischen Anwendungsgebieten bzw. im Bereich des Tissue Engineering bereits vielfach Einzug gefunden. Aber auch chemisch-biotechnologische Entwicklungen können von den Verfahren profitieren. So wurden Mikrofluidiksysteme und Bioreaktoren bereits erfolgreich durch RP gefertigt. Durch ALM ist ebenso die Herstellung von Reaktionseinheiten aus biokompatiblen Materialien wie ionotropen Gelen möglich. Ferner sind sehr komplexe Strukturierungen von Oberflächen im Nanometerbereich realisierbar, die für die Auftragung heterogener Katalysatoren oder auch Mikroorganismen eingesetzt werden können. Auch der Bereich Reaktoren- und Apparatebau kann von den Fortschritten in der additiven Fertigung profitieren. Verfahren wie selektives Laser- oder Elektronenstrahlschmelzen erlauben es, metallische Komponenten in nahezu beliebigen Geometrien zu fertigen. Somit können Strukturen verwirklicht werden, die mit konventionellen Fertigungstechniken nur sehr schwer oder überhauptnicht herstellbar wären. Durch Anwendung von rechnergestützter Modellierung können optimale Strukturen identifiziert und additiv gefertigt werden. Eine anschließende katalytische Funktionalisierung der Oberfläche ermöglicht die Herstellung strukturierter Reaktoren mit maßgeschneiderten Eigenschaften.
Bei der Verarbeitung nachwachsender Rohstoffe entsteht aus Cellulose oder Stärke u. a. das wichtige Produkt Glucose. Diese niedermolekulare Kohlenhydratquelle wird üblicherweise als Substrat für biotechnologische und chemische Synthesen verwendet. Ein wirtschaftlich interessantes Oxidationsprodukt der Glucose ist Gluconsäure, die beispielsweise als Lebensmittelzusatzstoff (E 574), in der Medizin und Metallindustrie Verwendung findet. Die Umsetzung des Monosaccharids zu Gluconsäure erfolgt entweder durch mikrobielle Fermentation oder der Oxidation an heterogenen Katalysatoren. Die Zielsetzung der Studie ist die Untersuchung der Glucoseoxidation an magnetisierbaren Gold-Nanopartikeln unter nachfolgender Bypass-Separation des Katalysators mittels einer neuen Mini-HGMS-Einheit (Hochgradient-Magnetseparation). Dieser Filtertyp ermöglicht die selektive Trennung magnetischer Partikel aus Suspensionen mit hohem Feststoffgehalt oder Viskosität. Erste Ergebnisse zeigen eine Beladungskapazität des selbstkonstruierten Mini-HGMS von 550 mg goldbeschichteter magnetisierbarer Nanopartikel. Die Oxidation erfolgt bei einem pH-Wertvon 9, bei 40 °C und mit 100 mM Glucose in einem begasten Rührkesselreaktor. Das System soll zukünftig zum Katalysatorrecycling von hochviskosen und Feststoffbelasteten Produktströmen aus Bioraffinerien eingesetzt werden.
Der zunehmende Bedarf an fossilen Rohstoffen bei gleichzeitig abnehmender Versorgungssicherheit führt zu einer intensiven Suche nach erneuerbaren Ressourcen. Ein vielversprechendes Ausgangsmaterial mit einer weltweiten Verfügbarkeit stellt Gras dar. In 2012 wurden in Deutschland 33 Millionen Tonnen (Heugewicht) Gras auf 4,82 Millionen Hektar Ackerland produziert, davon wurden 60,5 % siliert. Durch die Silierung kann Gras als Substrat zeitlich uneingeschränkt verfügbar sein, ohne dem Risiko des schnellen Verderbs ausgesetzt zu sein. Eine Schlüsselrolle im Rahmen des Silierprozesses nimmt die Produktion von Milchsäure ein. Milchsäure ist einbedeutendes biotechnologisches Produkt für die Lebensmittel- und die chemische Industrie. Im Rahmen dieser Arbeit wird die vollständige Umwandlung der fermentierbaren Zucker in der Silage zu Milchsäure angestrebt, um die maximale Ausbeute der organischen Säure zu erreichen. Im ersten Verfahrensschritt wird die Silage gepresst und der erhaltene Presskuchen einer Liquid-Hot-Water-Behandlung unterzogen. Durch diese einfache Vorbehandlung können hohe Glucoseausbeuten im nachfolgenden SSF-Schritt bei gleichzeitig geringem Enzymeinsatz und Chemikalienverbrauch realisiert werden. Zur Aufreinigung der Milchsäure wurden extraktive und chromatographische Methoden untersucht.
Adsorptive Vorbehandlung von Rohglycerin für die 1,3-Propandiol Fermentation mit Clostridium diolis
(2014)
Bei der Gewinnung von Fettsäuren aus Pflanzenölen, z. B. zur Herstellung von Biopolymeren, oder bei der Biodiesel- und Seifenproduktion, fällt Glycerin als Nebenprodukt an. Bei der Biokonversion dieses Rohstoffes zu 1,3-Propandiol wird der Produktionsorganismus Clostridium diolis durch Verunreinigungen im Rohglycerin gehemmt. Als inhibierende Substanzen konnten freie Fettsäuren identifiziert werden. Mithilfe eines adsorptiven Aufarbeitungsverfahrens ist es gelungen, die Fettsäuren zu entfernen und die Konversionseffizienz zu 1,3-Propandiol zu erhöhen.
In der Biotechnologie stellt Einzelstrang-DNA (ssDNA) eine Schlüsselrolle dar und fungiert z. B. als Baustein für die nanoskalige Feinmechanik oder als Affinitätsligand, ein sog. Aptamer. Hinsichtlich der industriellen Verwendung bieten Aptamere im Vergleich zu Antikörpern viele Vorteile, wie z. B. eine gute Renaturierung bzw. die Selektion für cytotoxische Moleküle. Aktuell wächst die Nachfrage für chimäre Aptamere von bis zu 200 n, um die simultane Bindung bzw. die Modifikation mehrerer Moleküle zu realisieren. Bis heute wird ssDNA mittels einer sequentiellen Synthese hergestellt, die eine Effizienz von ca. 99,5 % je Zyklus und bereits bei einer Produktlänge von 100 n nur noc hAusbeuten von max. 60 % zeigt. Um dem Bedarf an ssDNA im Bereich > 100 n zu entsprechen, wurden zwei enzymatische Verfahren zur Produktion dieser Makronukleotide entworfen. Die erste Technik basiert auf einerFestphasen-PCR und ermöglicht sowohlein Primer- als auch ein Templatrecycling. Das zweite Verfahren beruht auf einer Plasmidbasierten In-vivo-Amplifikation, der sog. AptaGENE®-Technologie. In einer einzigen Klonierung werden bis zu 100 Kopien des Monomers in einen Vektor kloniert. Nach einer Transformation folgt der reguläre Produktionsprozess in Form einer Kultivierung, Plasmidpräparation und sequenziellen Aufarbeitung von bis zu 6 · 10¹⁵ Makronukleotiden pro Milliliter Fermentationsvolumen.
Cytochrom P450 sind Häm-Proteine, die zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen (EC 1.14.xy) gehören. Eine wichtige Reaktion ist die Hydroxylierung nichtaktivierter C–H-Bindungen, die in technischen Systemen von großem Interesse ist. Durch die Verwendung von M-IDA-2-Partikeln ist eine direkte Aufreinigung mit gleichzeitiger Immobilisierung und die Applikation der Enzyme aus dem Zelllysat möglich. Damit ist das Verfahren mehr als fünf Stunden schneller als die konventionelle Chromatographie und mehr als 80 % der Aufreinigungszeit wird gespart. Mit dem isolierten nativen Enzym konnte die Plattformchemikalie 9,10-Dihydroxystearinsäure aus Ölsäure hergestellt werden. Unter anderem für die Kunststoffindustrie können aus diesem Produkt wichtige Monomere wie z. B. Azelainsäure hergestellt werden. Die Bildung des Produkts erfolgt in einem zweiphasigen Reaktionssystem an der Grenzfläche zwischen dem Öl und der wässrigen Phase als Feststoff. Um das immobilisierte Enzym aktiv in die obere Phase zu transportieren, wurde eine neue magnetische Mischvorrichtung entwickelt. Das Reaktionsprodukt wurde mit NMR, GC-MS und HPLC-MS analysiert und mit einem chemisch synthetisierten Standard von 9,10-Dihydroxystearinsäure verglichen. Derzeit werden Studien des immobilisierten Häms des Enzyms durchgeführt.
Üblicherweise werden biotechnologische Reaktionssysteme im mikrofluidischen Maßstab in vorstrukturierten Bauteilen oder mit auf Wellplatten basierenden Robotersystemen realisiert. In dem hier vorgestellten System werden chemische oder biologische Reaktionen mit magnetischen Mikroreaktoren (MR) durchgeführt, bei denen hydrophobe magnetische Mikropartikel einen wässrigen Kern umschließen. Solche MR bieten eine gute Kontrolle der Reaktionsbedingungen, eine verbesserte Sicherheit und Portabilität. Die neue Plattformtechnologie ermöglicht die zweidimensionale Bewegung der magnetischen MR auf einer planaren Ebene. Oberhalb oder unterhalb der Plattform werden Magnetfeldgradienten zum Manipulieren und Bewegen eines oder mehrerer magnetischer MR erzeugt. Die optimal auf die MR wirkenden magnetischen Kräfte werden experimentell ermittelt und simuliert. Die Aktivierung der Magnetfelder wird automatisiert durch elektrische Spulen mit Eisenkern bzw. Neodymmagnet gesteuert. Angewendet wurde das System beim reversiblen Öffnen von MR, um z. B. Reaktionspartner in den wässrigen Kern zu injizieren oder Proben zu entnehmen. Ferner wurde Lac-case A und b-Glucosidase auf einer Quarzglasoberfläche immobilisiert und mit einem MR zum Reagieren gebracht. Weiterhin wurden MR fusioniert und so ein wässriger Kern bestehend aus Laccase mit einem aus dem entsprechenden Substrat Syringaldazin vereint.
Prozessintegrierte Magnetseparation im Labormaßstab mittels High-Gradient Magnetic Separator (HGMS)
(2014)
Die Hochgradient-Magnetseparation (HGMS) stellt eine Alternative zu konventionellen Methoden der Proteinaufarbeitung wie Filtration und Chromatographie dar und dient zudem als Prozessintensivierung. Bisherige Separatoren sind für Anwendungen von mehreren Litern Prozessvolumina Fermentationsmedium und Gramm Magnetpartikel ausgelegt. Bei der Entwicklung und Anwendung neuartiger Magnetpartikeloberflächen ist die Verfügbarkeit großer Mengen nicht gegeben. Bisherige Filterkammern erhöhen zudem den Arbeitsaufwand und verursachen größere Partikelverluste bei Spülvorgängen oder der Reinigung aufgrund der Partikeladsorption. Für Anwendungen im Maßstab < 500 mL wird deshalb ein Miniatur-Hochgradientfilter (miniHGF) entwickelt. Das Modell wird im 3D-Drucker Makerbot Replicator 2 gefertigt und magne-isierbare Drähte zur Partikelabscheidung eingesetzt. Die Vergleichbarkeit mit einem etablierten Magnetseparator wird anhand der Aufnahme von Durchbruchskurven und Bestimmung der Filtereffizienz untersucht. Die Praxistauglichkeit mit kleinen Volumina wird in wiederholten Batch-Versuchen mit auf Magnetpartikeln immobilisiertem Enzym und einem kolorimetrischen Assay geprüft.
A platform technology for the automated reaction control in magnetizable micro-fluidic droplets
(2014)
Access to promising radiometals as isotopes for novel molecular imaging agents requires that they are routinely available and inexpensive to obtain. Proximity to a cyclotron center outfitted with solid target hardware, or to an isotope generator for the metal of interest is necessary, both of which can introduce significant hurdles in development of less common isotopes. Herein, we describe the production of ⁴⁴Sc (t₁⸝₂ = 3.97 h, Eavg,β⁺ = 1.47 MeV, branching ratio = 94.27%) in a solution target and an automated loading system which allows a quick turn-around between different radiometallic isotopes and therefore greatly improves their availability for tracer development. Experimental yields are compared to theoretical calculations.
An enzyme-based multi-parameter biosensor is developed for monitoring the concentration of formate, d-lactate, and l-lactate in biological samples. The sensor is based on the specific dehydrogenation by an oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)-dependent dehydrogenase (formate dehydrogenase, d-lactic dehydrogenase, and l-lactic dehydrogenase, respectively) in combination with a diaphorase from Clostridium kluyveri (EC 1.8.1.4). The enzymes are immobilized on a platinum working electrode by cross-linking with glutaraldehyde (GA). The principle of the determination scheme in case of l-lactate is as follows: l-lactic dehydrogenase (l-LDH) converts l-lactate into pyruvate by reaction with NAD+. In the presence of hexacyanoferrate(III), the resulting reduced β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is then regenerated enzymatically by diaphorase. The electrochemical detection is based on the current generated by oxidation of hexacyanoferrate(II) at an applied potential of +0.3 V vs. an Ag/AgCl reference electrode. The biosensor will be electrochemically characterized in terms of linear working range and sensitivity. Additionally, the successful practical application of the sensor is demonstrated in an extract from maize silage.
Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) hydrogel films with incorporated graphene oxide (GO) were developed and tested as light-stimulated actuators. GO dispersions were synthesized via Hummers method and characterized toward their optical properties and photothermal energy conversion. The hydrogels were prepared by means of photopolymerization. In addition, the influence of GO within the hydrogel network on the lower critical solution temperature (LCST) was investigated by differential scanning calorimetry (DSC). The optical absorbance and the response to illumination were determined as a function of GO concentration for thin hydrogel films. A proof of principle for the stimulation with light was performed.
Lately there has been an increasing concern about uranium toxicity in some districts of Punjab State located in the North Western part of India after the publication of a report (Blaurock-Busch et al. 2010) which showed that the concentration of uranium in hair and urine of children suffering from physical deformities, neurological and mental disorder from Malwa region (Fig. 1) of Punjab State was manifold higher than the reference ranges. A train which connects the affected region with the nearby city of Bikaner which has a Cancer Hospital has been nicknamed as Cancer Express due to the frenzy generated on account of uranium related toxicity.
A new microfluidic assembly method for semiconductor-based biosensors using 3D-printing technologies was proposed for a rapid and cost-efficient design of new sensor systems. The microfluidic unit is designed and printed by a 3D-printer in just a few hours and assembled on a light-addressable potentiometric sensor (LAPS) chip using a photo resin. The cell growth curves obtained from culturing cells within microfluidics-based LAPS systems were compared with cell growth curves in cell culture flasks to examine biocompatibility of the 3D-printed chips. Furthermore, an optimal cell culturing within microfluidics-based LAPS chips was achieved by adjusting the fetal calf serum concentrations of the cell culture medium, an important factor for the cell proliferation.
Light-stimulated hydrogel actuators with incorporated graphene oxide for microfluidic applications
(2015)
System und Verfahren zur Durchführung von chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen
(2015)
BACKGROUND
Currently, several techniques exist for the downstream processing of protein, phytic acid and sinapic acid from rapeseed and rapeseed meal, but no technique has been developed to separate all of the components in one process. In this work, two new downstream processing strategies focusing on recovering sinapic acid, phytic acid and protein from rapeseed meal were established.
RESULTS
The sinapic acid content was enhanced by a factor of 4.5 with one method and 5.1 with the other. The isolation of sinapic acid was accomplished using a zeolite-based adsorbent with high adsorptive and optimal desorption characteristics. Phytic acid was isolated using the anion-exchange resin Purolite A200®. In addition, the processes resulted in two separated protein fractions. The ratios of globulin and albumin ratio to the total protein were 59.2% and 40.1%, respectively. The steps were then combined in two different ways: (a) a ‘sequential process’ using the zeolite and A200 in batch processes; and (b) a ‘parallel process’ using only A200 in a chromatographic system to separate all of the compounds.
CONCLUSIONS
It can be concluded that isolation of all three components was possible in both processes. These could enhance the added value of current processes using rapeseed meal as a protein source. © 2015 Society of Chemical Industry