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C-terminal truncation of a metagenome-derived detergent protease for effective expression in E. coli
(2010)
Recently, a new alkaline protease named HP70 showing highest homology to extracellular serine proteases of Stenotrophomonas maltophilia and Xanthomonas campestris was found in the course of a metagenome screening for detergent proteases (Niehaus et al., submitted for publication). Attempts to efficiently express the enzyme in common expression hosts had failed. This study reports on the realization of overexpression in Escherichia coli after structural modification of HP70. Modelling of HP70 resulted in a two-domain structure, comprising the catalytic domain and a C-terminal domain which includes about 100 amino acids. On the basis of the modelled structure the enzyme was truncated by deletion of most of the C-terminal domain yielding HP70-C477.
This structural modification allowed effective expression of active enzyme using E. coli BL21-Gold as the host. Specific activity of HP70-C477 determined with suc-l-Ala-l-Ala-l-Pro-l-Phe-p-nitroanilide as the substrate was 30 ± 5 U/mg compared to 8 ± 1 U/mg of the native enzyme. HP70-C477 was most active at 40 °C and pH 7–11; these conditions are prerequisite for a potential application as detergent enzyme. Determination of kinetic parameters at 40 °C and pH = 9.5 resulted in KM = 0.23 ± 0.01 mM and kcat = 167.5 ± 3.6 s⁻¹. MS-analysis of peptide fragments obtained from incubation of HP70 and HP70-C477 with insulin B indicated that the C-terminal domain influences the cleavage preferences of the enzyme. Washing experiments confirmed the high potential of HP70-C477 as detergent protease.
Eine SPS im Kraftfahrzeug? Das geht ja gar nicht – da gibt es doch all die Hersteller für Kfz-Steuergeräte, die konfigurierbare Hardware anbieten. Im Prinzip ja, aber leider sind gerade die Sensoren oder Aktoren nicht ansteuerbar, die der Entwickler genau für sein aktuelles Projekt benötigt. Dieser Beitrag gibt einen kleinen Einblick in neue Möglichkeiten des Rapid Prototyping für mechatronische Systeme auf der Basis von Speicherprogrammierbaren Steuerungen (SPS).
In den letzten drei bis vier Jahren unterlag der Bereich der Bilanzierung und Offenlegung von unsicheren Steuerpositionen im IFRS- und US-GAAP-Abschluss einem stetigen Wandel. Sowohl nach US-GAAP als auch nach IFRS nehmen die Anforderungen an die Bilanzierung und Offenlegung beständig zu. Schon allein dies zeigt die Bedeutung, die dem Themenbereich der Steuerrisiken beigemessen wird. Aber nicht nur im Rahmen der Berichterstattung im Jahresabschluss stehen Steuerrisiken oben auf der Agenda, auch der amerikanische Internal Revenue Service (IRS) verfolgt das Thema sehr konsequent und plant, bestimmte Unternehmen zu Angaben von Steuerrisiken im Rahmen der Steuererklärungen zu verpflichten.
Der Aufsatz befasst sich mit den neueren Entwicklungen im Bereich der Bilanzierung und Offenlegung von unsicheren Steuerpositionen in der Rechnungslegung nach IFRS, US-GAAP und HGB und der Offenlegung von Steuerrisiken im Rahmen der Steuererklärung.
Latente Steuern stellen eine Schnittstelle zwischen handelsrechtlicher Rechnungslegung und Steuerrecht dar. Das Verhältnis von Handels- und Steuerrecht ist dabei keinesfalls stetig; vielmehr fordert die Dynamik des deutschen Steuerrechts in vielen Bereichen regelmäßige Anpassungen in der Bilanzierung in Handels- und Steuerbilanz. Dies gilt insbesondere für die Bilanzierung latenter Steuern im handelsrechtlichen Jahresabschluss, welche durch das BilMoG deutlich an Bedeutung gewonnen hat. Neben latenten Steuern auf temporäre Differenzen ist es nunmehr erforderlich, Verlustvorträge und die Folgen der Zinsschranke bei der Berechnung latenter Steuern zu berücksichtigen. Der nachfolgende Beitrag geht auf die Berücksichtigung von Verlust- und Zinsvorträgen und die Berücksichtigungsfähigkeit von EBITDA-Vorträgen bei der Berechnung latenter Steuern ein und beleuchtet dabei insbesondere auch praktische Fragestellungen.