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Molke als Nebenprodukt der Käseherstellung wurde lange Zeit als Abfall betrachtet. Bedingt durch ihren hohen BOD (biological oxygen demand) war die direkte Einleitung in Gewässer, aber auch der mikrobielle Abbau in Kläranlagen bedenklich. Falls eine Weiterverarbeitung der Molke stattfand, so geschah dies meist zu Molkepulver oder Proteinkonzentrat. Als Untersuchungen der Molkeproteine jedoch unter pharmazeutischen Gesichtspunkten interessante Eigenschaften nahelegten, stieg das Interesse am Bioprodukt Molke und ihren Proteinen an. So stehen beispielsweise für die Molkeproteine a-Lactalbumin (ala) und b-Lactoglobulin (blg) antibakterielle, anticancerogene und diverse andere physiologische Effekte in der Diskussion. Gegenwärtig finden meist Membranverfahren zur Aufreinigung von Molkeproteinen Anwendung. Als alternatives Verfahren wurde am Institut für Bioverfahrenstechnik in Kaiserslautern ein chromatographisches Verfahren entwickelt, bei dem natürliche Tonminerale zum Einsatz kamen. Nach chemischer und physikalischer Modifikation des Ausgangsmaterials durch den Hersteller Süd-Chemie wurden drei der Adsorber für nähere Untersuchungen zur Auftrennung von Molkeproteinen aus Molkekonzentrat herangezogen. Nach einer Cross-Flow-Filtration des Molkekonzentrats erfolgte die Aufreinigung der Molkeproteine in einem FPLC-System.
Die wachsende Produktpalette von z. B. Pharmazeutika geht mit einer steigenden Nachfrage für hochsensitive/schonende Aufreinigungstechniken einher. Bisherige Verfahren führen oft zu geringer Reinheit und verminderter Bioaktivität, zeigen eine Limitation der Analytengröße oder bedingen dessen Modifikation. Durch die Kombination von mikroskaligen Magnetpartikeln und spezifisch wechselwirkenden Einzelstrang-DNA-Oligonukleotiden, den sog. ssDNA-Aptameren, sind eine höhere Selektivität/Reinheit und eine Automatisierung möglich. In diesem Kontext werden zum einen ssDNA-Amplifikationstechniken und zum anderen der praktische Einsatz von Aptameren in einer Magnetseparation vorgestellt. Die ssDNA-Synthese basiert auf einem In-vivo-dsDNA-Produktionsschritt mittels eines rekombinanten Escherichia coli. Die als High-copy-Plasmid organisierte Sequenz wird in vitro durch Kombination verschiedener enzymatischer Reaktionen in die funktionelle ssDNA überführt. Diese Technik bedingt nur minimale Instrumentierung bzw. Prozessregelung. Die zweite Synthesetechnik wird in Form eines In-vitro-Amplifikationsverfahrens realisiert und beruht auf dem Prinzip einer PCR (Potenzial zu einer Automatisierung bzw. Miniaturisierung). Die gewonnenen Aptamere werden im Anschluss in einem auf Magnetpartikeln basierten Trennverfahren zur Isolationvon 6xHis-tag-Proteinen bezüglich ihrer Eigenschaften untersucht.
In der Biotechnologie stellt Einzelstrang-DNA (ssDNA) eine Schlüsselrolle dar und fungiert z. B. als Baustein für die nanoskalige Feinmechanik oder als Affinitätsligand, ein sog. Aptamer. Hinsichtlich der industriellen Verwendung bieten Aptamere im Vergleich zu Antikörpern viele Vorteile, wie z. B. eine gute Renaturierung bzw. die Selektion für cytotoxische Moleküle. Aktuell wächst die Nachfrage für chimäre Aptamere von bis zu 200 n, um die simultane Bindung bzw. die Modifikation mehrerer Moleküle zu realisieren. Bis heute wird ssDNA mittels einer sequentiellen Synthese hergestellt, die eine Effizienz von ca. 99,5 % je Zyklus und bereits bei einer Produktlänge von 100 n nur noc hAusbeuten von max. 60 % zeigt. Um dem Bedarf an ssDNA im Bereich > 100 n zu entsprechen, wurden zwei enzymatische Verfahren zur Produktion dieser Makronukleotide entworfen. Die erste Technik basiert auf einerFestphasen-PCR und ermöglicht sowohlein Primer- als auch ein Templatrecycling. Das zweite Verfahren beruht auf einer Plasmidbasierten In-vivo-Amplifikation, der sog. AptaGENE®-Technologie. In einer einzigen Klonierung werden bis zu 100 Kopien des Monomers in einen Vektor kloniert. Nach einer Transformation folgt der reguläre Produktionsprozess in Form einer Kultivierung, Plasmidpräparation und sequenziellen Aufarbeitung von bis zu 6 · 10¹⁵ Makronukleotiden pro Milliliter Fermentationsvolumen.
In Anbetracht des zu erwartenden Rückgangs der Verfügbarkeit fossiler Rohstoffe müssen nicht nur für den Energiesektor, sondern auch für die Herstellung industrieller Produkte alternative Rohstoffe gefunden werden. Ein Beispiel für einen nicht in Nahrungsmittelkonkurrenz stehenden nachwachsenden Rohstoff ist grüne Biomasse wie Gras und Klee. Diese lassen sich in Deutschland auf großen Flächen anbauen und enthalten eine Vielzahl potenzieller Substrate für Fermentationen.
Grassilage stellt einen nachwachsenden Rohstoff mit großem Potenzial dar. Neben Cellulose und Hemicellulose enthält sie auch organische Säuren, insbesondere Milchsäure. In einem Bioraffinerie-Projekt wird die Milchsäure aus der Silage isoliert und mit gentechnisch optimierten Stämmen zu L-Lysin weiterverarbeitet. Die Lignocellulose wird hydrolysiert und zu Ethanol fermentiert. Ein besonderes Augenmerk liegt auf der Integration der unterschiedlichen Prozesse sowie der einzelnen Prozessschritte zu einem Gesamtprozess, der sämtliche Inhaltsstoffe der Silage verwertet.
Grasschnitt hat in Deutschland ein beträchtliches Potenzial als nachwachsender Rohstoff. Da frischer Grasschnitt nur in den Sommermonaten zur Verfügung steht und Gras bei der Lagerung verrottet, wird er unter anderem durch Silierung konserviert. Während der Silierung wird ein Teil der wasserlöslichen Kohlenhydrate unter anaeroben Bedingungen zu Milchsäure fermentiert. Die Kombination aus Luftabschluss und Ansäuerung bewirkt die Konservierung der Silage. Silage als weit verbreitetes landwirtschaftliches Erzeugnis ist somit ein potentieller, in großen Mengen verfügbarer Lieferant für eine Vielzahl von Substraten für mikrobielle Fermentationen. Diese können entweder durch die Hydrolyse der in den Pflanzen enthaltenen Cellulosen und Hemicellulosen oder durch die Verwendung eines Silagepresssaftes nutzbar gemacht werden. Die zu entwickelnden Prozesse sollen die verbleibenden Kohlenhydrate, inklusive der Cellulose und Hemicellulose, sowie die Milchsäure nutzen. Die in der Silage enthaltenen Zucker sollen zu Ethanol, Itakonsäure und Bernsteinsäure und die Milchsäure zu 1,2-Propandiol umgesetzt werden. Anfallende Reststoffe wie Hydrolyserückstände, Presskuchen und Fermentationsrückstände sollen bei allen zu etablierenden Prozessen entweder als Viehfutter verwendet oder der Biogasproduktion zugeführt werden können, wodurch eine vollständige stoffliche und energetische Nutzung der Silage erreicht wird.
Gras hat ein hohes Potenzial als nachwachsender Rohstoff. Bei ungeeigneter Lagerung verderben Gräser allerdings innerhalb weniger Tage. Dieser Nachteil kann durch die Silierung des Grasschnittes behoben werden. Eines der wichtigsten in der Silage enthaltenen Produkte ist die Milchsäure. Um diese für weitere Aufarbeitungsschritte zugänglich zu machen, wird aus der Silage ein Presssaft hergestellt. Die Milchsäure wird aus einem Silagepresssaft mittels Extraktion durch ionische Flüssigkeiten isoliert. Dabei wird zum einen eine reine Milchsäure hergestellt, die z. B. für die Herstellung von Polymilchsäure genutzt werden kann. Zum anderen wird ein weniger aufgereinigter Extrakt gewonnen, der für die fermentative Produktion von L-Lysin und 1,2-Propandiol genutzt werden soll. Im Rahmen des Projekts erfolgt die gentechnische Optimierung von Corynebacterium glutamicum für die Umsetzung von Milchsäurezu L-Lysin. Die im nach der Pressung verbleibenden Presskuchen enthaltenen Grasfasern bestehen zu einem großen Teil aus Polysacchariden. Diese werden hydrolysiert und die dabei freigesetzten Zucker zu Grundchemikalien wie Ethanol oder Itakonsäure fermentiert. Im Rahmen einer vollständigen Nutzung der Silage wird das Raffinat aus der Milchsäureextraktion als Mediumsupplement in der Fermentation eingesetzt, was die Zugabe weiterer Medienbestandteile überflüssig macht. Die Rückstände der Hydrolysen und Fermentationen sollen darüberhinaus für die Herstellung von Biogas genutzt werden.
Gräser sind in der Lage, einen großen Teil der für eine biobasierte Wirtschaft benötigten Biomasse zur Verfügung zu stellen. Wie bei anderen lignocellulosehaltigen nachwachsenden Rohstoffen erfordert die Verwertung der im Gras enthaltenen Polysaccharide einen mehrstufigen Prozess aus Vorbehandlung, Hydrolyse und Fermentation. In Gräsern ist die Hemicellulose mitP henolcarbonsäuren wie Ferula- und p-Coumarsäure verestert, die die enzymatische Hydrolyse der Cellulose und Hemicellulose ebenso effektiv behindern wie Lignin. Anders als bei holzigen Rohstoffen ermöglicht dieser Aufbau aber eine enzymatische Vorbehandlung, mit der die Phenolcarbonsäuren abgespalten werden können. Da die bei der Vorbehandlung eingesetzten Enzyme in ihrer natürlichen Funktion synergistisch mit cellulytischen Enzymen zusammenarbeiten, besitzen sie ähnliche Optima wie die für die Hydrolyse der Polysaccharide eingesetzten Cellulasen und Hemicellulasen. Diese Eigenschaft ermöglicht die Integration von Vorbehandlung und Hydrolyse in einem einzigen Verfahrensschritt. Durch die Einführung der enzymatischen Vorbehandlung konnte das in der Literatur bekannte SSF-Verfahren für die Herstellung von Ethanol aus Gräsern um die Vorbehandlungsstufe erweitert werden. Das so realisierte simultaneous pretreatment, saccharification and fermentation (SPSF)-Verfahren stellt eine vollständige Integration der drei für die Nutzung von Lignocellulose nötigen Verfahrensschritte in der grünen Bioraffinerie dar.
Gräser sind in der Lage, einen großen Teil der für eine biobasierte Wirtschaft benötigten Biomasse zur Verfügung zustellen. Um eine ganzjährige Nutzung des Grases zu gewährleisten, muss eine stabile Lagerung des Grases erreicht werden, was z. B. durch Silieren möglich ist. Die konservierende Wirkung der Silierung beruht auf der Bildung organischer Säuren. Um diese zu gewinnen, wird die Silage gepresst, die organischen Säuren über Flüssig/Flüssig-Extraktion aus dem Presssaft abgetrenntund mittels chromatographischer Methoden weiter aufgereinigt. Im präsentierten Konzept werden die im Presskuchen enthaltenen Lignocellulosen hydrolysiert und die erhaltenen Monosaccharide zu Ethanol fermentiert. Die Phenolsäuren, die in Gräsern die Rolle des Lignins übernehmen, können simultan mit der Hydrolyse der Polysaccharide enzymatisch abgetrennt und als Nebenprodukt gewonnen werden. Die nach der Abtrennung des Ethanols verbleibenden Fermentationsreststoffe werden für die Herstellung von Biogas verwendet.
Aus hölzernen Cellulosen und Hemicellulosen können durch enzymatische Hydrolyse fermentierbare Zucker für die Herstellung von Chemikalien und Treibstoffen gewonnen werden. Die bisherige Forschung fokussiert sich oft auf die Nutzung dieser Zucker zur Gewinnung von Ethanol. Daneben muss aber auch die stoffliche Nutzung zur Gewinnung von Grundchemikalien berücksichtigt werden. Eine solche Grundchemikalie ist Itakonsäure. Obwohl die biotechnologische Itaconsäureproduktion bereits eingehend untersucht und etabliert ist, gestaltet sie sich im Rahmen von Bioraffinerien der zweiten Generation als schwierig, da der überwiegend verwendete Produktionsorganismus gegen eine weite Bandbreite von Inhibitoren sensibel ist. Die Herstellung von Itaconsäure aus Buchenholzhydrolysaten wird im Rahmen der deutschen Lignocellulose-Bioraffinerie entwickelt. Die unbehandelten Hydrolysate ermöglichen weder das Wachstum von Aspergillus terreus noch die Bildung von Itaconsäure. Daher werden Möglichkeiten zur Konditionierung des Hydrolysates mit dem Ziel einer Itaconsäureproduktion mit hohen Ausbeuten und Konzentrationen vorgestellt.
"Biologie trifft Mikroelektronik", das Motto des Instituts für Nano- und Biotechnologien (INB) an der FH Aachen, unterstreicht die zunehmende Bedeutung interdisziplinär geprägter Forschungsaktivitäten. Der thematische Zusammenschluss grundständiger Disziplinen, wie die Physik, Elektrotechnik, Chemie, Biologie sowie die Materialwissenschaften, lässt neue Forschungsgebiete entstehen, ein herausragendes Beispiel hierfür ist die Nanotechnologie: Hier werden neue Werkstoffe und Materialien entwickelt, einzelne Nanopartikel oder Moleküle und deren Wechselwirkung untersucht oder Schichtstrukturen im Nanometerbereich aufgebaut, die neue und vorher nicht bekannte Eigenschaften hervorbringen.
Vor diesem Hintergrund bündelt das im Jahre 2006 gegründete INB die an der FH Aachen vorhandenen Kompetenzen von derzeit insgesamt sieben Laboratorien auf den Gebieten der Halbleitertechnik und Nanoelektronik, Nanostrukturen und DNA-Sensorik, der Chemo- und Biosensorik, der Enzymtechnologie, der Mikrobiologie und Pflanzenbiotechnologie, der Zellkulturtechnik, sowie der Roten Biotechnologie synergetisch. In der Nano- und Biotechnologie steckt außergewöhnliches Potenzial! Nicht zuletzt deshalb stellen sich die Forscher der Herausforderung, in diesem Bereich gemeinsam zu forschen und Schnittstellen zu nutzen, um so bei der Gestaltung neuartiger Ideen und Produkte mitzuwirken, die zukünftig unser alltägliches Leben verändern werden.
Im Folgenden werden die verschiedenen Forschungsbereiche kurz zusammenfassend vorgestellt und vorhandene Interaktionen anhand von exemplarisch ausgewählten, aktuellen Forschungsprojekten skizziert.
Die Darstellung der N-[2-(p-Biphenylyl)isopropyloxycarbonyl]-Derivate (Bpoc-Derivate) des Cysteins unter Verwendung der Thiolschutzgruppen Tetrahydropyranyl (Thp) für 1, Diphenylmethyl (Dpm) für 2, Trityl (Trt) für 3 und S-tert.-Butyl (SBut) für 4 sowie die Synthese von aktivierten Estern der Bpoc-Derivate des Glycins (5), Isoleucins (6) und Prolins (7) werden beschrieben. An einem Beispiel wird die Möglichkeit aufgezeigt, die Bpoc-Gruppe über das Bpoc-Azid nachträglich in den Peptidverband einzuführen.
Simultane Atline-Quantifizierung von Magnetpartikeln und Mikroorganismen bei einer HGMS-Filtration
(2015)
Es wird eine neue Atline-Messmethode vorgestellt, mit der während einer Hochgradienten-Magnetseparation (HGMS)-Filtration eine simultane Quantifizierung von Magnetpartikeln und Mikroorganismen im Filtrat vorgenommen werden kann. Dabei gelingt die Quantifizierung signifikant besser als mit bisher verwendeten Messmethoden. Mit dieser Methode ist es möglich, die Trennleistung einer HGMS-Filtration zu bestimmen und einen Filterdurchbruch durch Konzentrationsanstiege im Bereich einiger µg L−1 von Magnetpartikeln im Filtrat frühzeitig zu detektieren, ohne dass nennenswerte Partikelmengen verloren gehen.
Die Hochgradientenmagnetseparation (HGMS) ist eine Methode zur Aufreinigung von biopharmazeutischen Produkten. Mit dieser Methode lässt sich in nur einem Schritt eine Fest/Fest/Flüssig-Trennung erzielen, was zu einer erheblichen Zeit- und Kostenersparnis im Downstreaming führt. Dennoch steht ihr industrieller Einsatz noch aus, was u. a. am Mangel an Analysenmethoden liegt, um die HGMS quantifizierbar zu machen. Gerade in der Pharmaproduktion werden Prozesse gebraucht, die gemäß den einschlägigen Vorschriften (cGMP) validiert und deren verfahrenstechnische Anlagenteile qualifiziert werden können. Die Schwierigkeit ist die Messung der magnetischen Mikrosorbentien in der Suspension, in der auch Zellen oder Zelltrümmer vorliegen. Im Rahmen eines Forschungsprojektes im „Zentralen Innovationsprogramm Mittelstand“ des BMWi wurden verschiedene Analysenmethoden untersucht. Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine Charakterisierung von Partikeln und eine simultane quantitative Messung. Durch die multiparametrige Messung kann zwischen Zellen, Zelltrümmern und Magnetpartikeln unterschieden werden. Die At-line-Einbindung des Durchflusszytometers ist durch den Einsatz einer externen Pumpe möglich. Über eine automatisierte Messwertanalyse kann der HGMS-Prozess mittels der Durchflusszytometrie gesteuert werden.
Die tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe (Boc) läßt sich mittels reiner Trifluoressigsäure nicht selektiv neben dem Benzyloxycarbonyl-Rest (Z) abspalten. Das gelingt auch nicht mit Lösungen von Trifluoressigsäure bzw. Chlorwasserstoff in organischen Lösungsmitteln. Kern-substituierte Z-Gruppen wie Z(pCl), Z(mCl) oder Z(pNO₂) sind zwar stabiler, werden aber von den obengenannten Reagenzien ebenfalls angegriffen bzw. sind nicht mehr acidolytisch abspaltbar. – Mit 70proz. wäßriger Trifluoressigsäure gelingt die Abspaltung von Boc neben Z dagegen fast selektiv; dabei werden aber Benzylester, besonders Glutaminsäure-γ-benzylester, teilweise hydrolysiert, während Methyl- sowie Äthylester nahezu beständig sind. Die Brauchbarkeit des Abspaltungsverfahrens wird anhand der schrittweise durchgeführten Synthese zweier Heptapeptid-Derivate gezeigt. – Ähnlich spezifisch gelingt die Abspaltung von Boc mit Bortrifluorid-ätherat in Eisessig; Benzylester sind gegenüber diesem Reagenz stabiler als gegen wäßrige Trifluoressigsäure. Das Bortrifluorid-Verfahren eignet sich besonders für die Abspaltung von Boc-Gruppen neben säurelabilen Thiol-Schutzgruppen (Tetrahydropyranyl- bzw. Trityl-Rest) sowie neben dem Cyclocystinyl-Rest. Die Leistungsfähigkeit der Methode wird durch die Synthese zweier Peptid-Derivate mit S-Trityl-Schutzgruppen belegt. Als Nebenreaktion ist die Acetylierung von aliphatischen Hydroxylgruppen möglich. Sie läßt sich vermeiden, wenn man die Spaltung in anderen Lösungsmitteln durchführt. Die als Modellverbindungen für Stabilitätsuntersuchungen verwendeten Nε-acylierten Lysin-Derivate werden mit dem Aminosäureanalysator quantitativ neben Lysin bestimmt.
Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro [Offenlegungsschrift]
(2004)
Frühregenfeste Dichtmasse auf Basis wässriger Acrylatdispersionen und Verfahren zu ihrer Herstellung
(1993)
Frühregenfeste Dichtmasse auf Basis wässriger Acrylatdispersionen und Verfahren zu ihrer Herstellung
(1993)
Die ökonomische Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen und der klimatische Wandel durch die Nutzung dieser haben zu einer intensiven Suche nach erneuerbaren Rohstoffen für die Produktion von Chemikalien und Treibstoffen geführt. Ein viel versprechender Rohstoff in diesem Zusammenhang sind Zucker, die mittels enzymatischer Hydrolyse aus Lignocellulose gewonnen werden können. Die Fermentation erfolgt mit Cellulose- bzw. Hemicellulose-Fraktionen, welche durch thermo-chemische Vorbehandlung von Holz gewonnen und anschließend enzymatisch hydrolysiert werden. Die in den Hydrolysaten enthaltenen Zuckermonomere dienen als Kohlenstoffquelle für die Produktion von Ethanol. Da sowohl Glucose als auch Xylose in den unterschiedlichen Fraktionen enthalten sind, wird zur Umsetzung dieser eine Co-Fermentation zweier Hefen durchgeführt. Im Rahmen der Optimierung dieser Fermentationen werden neben der Ergänzung der Hydrolysate durch notwendige Salze auch Verfahrenweisen wie Fed-Batch-Fermentationen untersucht. Ein weiterer interessanter Ansatz, welcher in diesem Rahmen geprüft wird, ist die enzymatische Hydrolyse der Lignocellulose-Fraktionen und die simultane Fermentation der dabei entstehenden Zucker in einem Schritt. Des Weiteren wurde die Eignung der Hydrolysate für die Biomasseproduktion anderer Mikroorganismen wie Escherichia coli getestet.